研究背景结核病（tuberculosis,TB）是目前年致死人数全球排名第一的感染性疾病,由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,MTB）感染引起,主要侵袭肺部。2016年,据世界卫生组织（World Health Organization,WHO）统计,结核致死人数高达167万,新增感染人数高达1040万。同时耐药结核菌的感染持续威胁着人类健康,2016年新出现的耐一线抗结核药物利福平的MTB感染高达60万,且其中有49万例为多重耐药MTB感染,上述病例有47%集中在印度、中国和俄罗斯。因此,结核病仍然严重威胁着人类的健康,并对全球范围内的公共卫生造成沉重的负担,急需对MTB的感染途径、免疫逃逸及免疫系统的杀伤清除机制进行深入研究,为寻找新的有效对抗MTB的药物及预防靶点提供新的思路。通常意义上,我们认为针对MTB感染的有效免疫应答依赖于T细胞介导的适应性免疫反应,然而先天性免疫应答通过控制潜伏MTB的生长,从而与适应性免疫应答互补,共同抵抗MTB的感染。在此过程中,肺泡巨噬细胞和肺上皮细胞共同组成了MTB入侵的第一道防御屏障。已有研究证明,Ⅱ型肺细胞在对抗多种侵袭的宿主防御过程中发挥重要作用,其中也包括MTB感染。在抵御MTB的入侵的过程中,肺上皮细胞除了能发挥物理性阻隔作用,还能够分泌多种具有拮抗病原体生长的抗菌肽（Antimicrobial peptides,AMPs）。抗菌肽是由50-100个氨基酸组成的一组多肽,存在于多种组织和细胞中。它们的生物学效应,主要是通过插入双层膜结构并形成孔隙来杀死各种微生物,因此在先天免疫系统中扮演关键效应器的角色。根据结构和生物学分布的差异,抗菌肽主要分为三个家族:defensins、cathelicidins和histatins,它们对MTB在内的多种微生物（如细菌,真菌和一些病毒）均具有拮抗活性。MTB感染可刺激人角膜成纤维细胞、人内皮细胞分泌defensins家族成员β-defensin 1（human β-defensin 1,hBD1）。小鼠中,MTB感染可促进β-defensin 3（BD3）和β-defensin 4（BD4）的表达。细菌侵袭过程中,hBD1和hBD3在上皮屏障防御系统中发挥关键作用。同时,人类呼吸道上皮细胞也可通过表达hBD1在内的多种抗菌肽,发挥重要的抗微生物入侵功能。相较于defensin,关于cathelicidins的抗MTB功能和机制具有相对成熟和广泛的研究。目前已知人类cathelicidin抗菌肽基因（cathelicidin antimicrobial peptide,CAMP）能够编码约18 KDa的无活性前体蛋白,命名为hCAP18。在表达抗菌肽的人嗜中性粒细胞、上皮细胞、巨噬细胞和其他细胞中,hCAP18蛋白通过蛋白水解作用被剪切,释放C端,形成由N端37个氨基酸组成的活性抗菌肽——LL37。临床研究表明,LL37在MTB患者中高表达,并有效拮抗MTB感染:LL37可以改变MTB的超微结构,损伤细胞壁,并使细胞质收缩,从而抑制被感染细胞中MTB的生长。然而,在MTB感染的过程中,肺上皮细胞如何通过调控活性抗菌肽的产生来发挥抗菌效应的机制,尚需进一步研究。抗菌肽的表达过程通常为首先表达无活性的前体蛋白,接着前体蛋白被蛋白酶切割从而释放具有抗菌功能的活性肽,针对这一翻译后修饰过程的调节可直接影响到上皮细胞的抗菌活性。例如,LL37和α-defensin（亦称human neutrophil peptides,HNPs）均能通过蛋白酶水解过程从其前体蛋白质中释放,并且目前已经发现丝氨酸蛋白酶3（serine protease cleavage 3）能够在胞吐过程中将hCAP18切割成LL37。由于抗菌肽发挥功能主要依赖其活性肽在胞内的表达水平,因此,相较于针对抗菌肽基因表达的调控,针对抗菌肽前体剪切和相关蛋白酶功能的调控可能更能够影响抗菌肽活性肽的表达。但是,针对抗菌肽表达的调控因受细胞类型、微生物结构和炎症介质等众多因素的影响,呈现多样性,目前关于抗菌肽前体的剪切机制尚未完全了解。近年研究发现,自噬（Autophagy）作为一种细胞维持自我稳态的生理过程,已被证实也能参与剪切抗菌肽前体,从而产生活性抗菌肽。通常意义上认为,在MTB感染的细胞中产生的自噬小体,可以包裹含有MTB的吞噬体,在自噬小体的介导下,包裹MTB的吞噬体更易与溶酶体融合,并由溶酶体内的蛋白水解酶降解菌体。与此同时,自噬小体在包裹MTB吞噬体的同时,还会通过自噬衔接蛋白（autophagic adapter proteins）将胞质中的一些无害成分（如抗菌肽前体）有选择地包裹进自噬体,同样经过溶酶体水解酶的降解,形成一些活性短肽,从而起到杀伤MTB的作用。上述研究提示,自噬发生的过程中可产生活性抗菌肽,这一过程可能同时也是自噬发挥对抗胞内菌感染的一种新机制。这一 MTB杀伤新机制,为进一步研究抗结核免疫机制和开拓新的结核病治疗方法提供了可能。然而,目前已报道剪切过程与自噬相关的抗菌肽数量非常有限,已被证实可通过自噬形成活性肽的胞质蛋白仅有核糖体蛋白rps30,其由自噬衔接蛋白p62介导进入自噬体,在自噬溶酶体中被剪切而产生具有抗菌作用的短肽,这些短肽可协同溶酶体水解酶,对同时被包裹进自噬体的MTB起到杀伤作用。那么,是否存在其它的通过自噬途径剪切产生的新型抗菌肽?仍需进一步探究。本课题研究了MTB及卡介苗（Bacillus Calmette-Geurin,BCG）感染过程中,人肺上皮细胞内抗菌肽hBD1及LL37表达的变化情况,并验证得知这类细胞能够在MTB入侵过程中通过表达抗菌肽hBD1和LL37发挥抗MTB功能。在此研究基础上,我们继续深入探讨了自噬及溶酶体对抗菌肽表达的影响,验证了自噬衔接蛋白P62在抗菌肽表达过程中的作用,以及在自噬发挥杀伤BCG作用的过程中抗菌肽的重要作用。阐明上述机制,将有助于进一步理解肺上皮细胞作为第一道免疫屏障对抗MTB感染的机制和自噬对抗胞内MTB的新机制,对结核防治具有重要意义。研究内容1.寻找MTB感染过程中能够在肺上皮细胞中高表达的抗菌肽,并验证它们在肺上皮细胞对抗MTB过程中的作用;2.筛选BCG感染肺上皮细胞后高表达的抗菌肽,并确证其通过自噬剪切途径发挥对抗BCG感染的作用;3.验证自噬通过剪切抗菌肽前体产生活性抗菌肽对抗胞内MTB的功能。研究方法1.抗菌肽hBD1和LL37在结核分枝杆菌感染过程中发挥抗菌功能a.采用实时荧光定量PCR（Real-time PCR）检测MTB患者与健康志愿者外周血单个核细胞（PBMCs）中7种抗菌肽的mRNA表达;b.采用免疫组织化学染色,检测MTB患者与健康志愿者肺部病理切片中抗菌肽的表达;c.采用Real-time PCR及Western blot,检测BCG感染肺上皮细胞A549后7种抗菌肽的mRNA和蛋白表达;d.使用抗菌肽的siRNA处理细胞,然后采用BCG感染A549细胞,通过平板菌落计数（CFU）实验,检测抗菌肽调节肺上皮细胞杀伤BCG的效应。2.抗菌肽的产生受A549细胞自噬水平的调节a.BCG感染A549细胞后,分别使用自噬激动剂雷帕霉素和自噬抑制剂3-Methyladenine（3-MA）处理,Real-time PCR及Western blot检测A549细胞中抗菌肽的mRNA和蛋白表达;b.构建LC3-GFP蛋白稳定过表达的A549细胞,BCG感染后,使用自噬激动剂雷帕霉素和自噬抑制剂3-MA处理,免疫荧光染色结合激光扫描共聚焦显微镜检测A549中抗菌肽与LC3指示的自噬小体的共定位;c.使用另一种自噬诱导剂--饥饿培养基EBSS--诱导A549细胞自噬,Real-time PCR及Western blot检测胞内抗菌肽的mRNA和蛋白表达;d.使用siRNA沉默A549细胞中自噬相关蛋白ATG5和ATG7,采用BCG感染细胞后,Real-time PCR及Western blot检测胞内抗菌肽的mRNA和蛋白表达。3.溶酶体介导自噬过程产生活性抗菌肽a.采用BCG感染A549细胞后,使用自噬溶酶体形成抑制剂Baf A1抑制细胞内自噬体与溶酶体的融合,Real-time PCR及Western blot检测A549中抗菌肽的mRNA和蛋白表达;b.采用BCG感染A549细胞后,使用溶酶体功能抑制剂NH4Cl处理细胞,Real-time PCR及Western blot检测A549中抗菌肽的mRNA和蛋白表达;c.采用BCG感染A549细胞后,使用自噬溶酶体形成抑制剂Baf A1抑制细胞内自噬体与溶酶体的融合,免疫荧光染色结合激光扫描共聚焦显微镜检测检测抗菌肽与自噬体及溶酶体的共定位现象;d.采用BCG感染A549细胞后,使用溶酶体功能抑制剂NH4Cl处理细胞,免疫荧光染色结合激光扫描共聚焦显微镜检测检测抗菌肽与自噬体及溶酶体的共定位现象。4.自噬衔接蛋白p62通过招募抗菌肽前体调节抗菌肽活性肽的产生a.采用siRNA沉默A549细胞中p62的表达,BCG感染后,Real-time PCR及Western blot检测胞内抗菌肽的mRNA和蛋白表达;b.采用BCG感染A549细胞后,免疫荧光染色结合激光扫描共聚焦显微镜检测抗菌肽与自噬体及p62的共定位现象;c.采用BCG感染A549细胞后,免疫共沉淀检测抗菌肽与p62的相互作用。5.自噬剪切产生抗菌肽为自噬杀伤结核分枝杆菌的机制之一a.采用BCG感染A549细胞,Western blot检测A549细胞中LC3-Ⅱ的蛋白表达水平;b.使用自噬激动剂雷帕霉素和抗菌肽的siRNA处理细胞,BCG感染A549细胞后,通过平板菌落计数（CFU）实验,检测在自噬水平上调时沉默抗菌肽能够降低自噬对BCG的杀伤作用。研究结果1.结核患者的PBMCs及肺上皮Ⅱ型细胞中,抗菌肽hBD1及LL37表达水平上调;2.BCG感染人肺上皮细胞A549细胞,抗菌肽hBD1及LL37表达水平上调;3.自噬激动剂雷帕霉素和饥饿培养基EBSS均能诱导抗菌肽hBD1和LL37活性肽蛋白水平上调,但不能影响它们的mRNA水平;同时,使用自噬抑制剂3-MA处理正常A549细胞,或在ATG5/7表达沉默的细胞中,抗菌肽hBD1和LL37活性肽蛋白水平下调,而mRNA水平无变化;4.使用自噬体与溶酶体融合抑制剂Baf A1处理细胞,抗菌肽hBD1和LL37的蛋白水平下调,而mRNA水平不受影响。此外,使用溶酶体功能抑制剂NH4C1处理细胞,同样使得抗菌肽hBD1和LL37的蛋白水平下调,而mRNA水平不受影响;5.使用siRNA沉默自噬衔接蛋白p62,抗菌肽hBD1和LL37的蛋白水平下调,而mRNA水平不受影响。同时,使用CO-IP技术捕获与p62结合的蛋白,从中检测到hBD1和LL37,证实p62与hBD1、LL37存在结合作用;6.使用雷帕霉素诱导细胞自噬水平上调,同时使用siRNA沉默抗菌肽hBD1和LL37,发现自噬对BCG的杀伤作用下降。结论本课题研究发现,在结核病人的外周血单个核细胞及肺上皮Ⅱ型细胞中可观察到抗菌肽hBD1和LL37的高表达,同时BCG感染也可诱导人肺上皮细胞A549细胞中抗菌肽hBD1和LL37表达,并且验证得到此两种抗菌肽在肺Ⅱ型上皮细胞抗结核过程中发挥作用。继续深入探究发现,上皮细胞内细胞自噬的发生水平能够影响抗菌肽活性肽的产生,且这种影响为转录后水平的调控,此过程中自噬衔接蛋白p62发挥着重要作用,它能够选择性地招募抗菌肽hBD1和LL37前体至自噬体。此外,自噬体及自噬溶酶体形成过程及溶酶体功能对抗菌肽活性肽的产生也存在影响。在此研究基础上,我们发现肺Ⅱ型上皮细胞自噬水平上调能够增强对胞内MTB生长的抑制作用,且在此过程中抗菌肽hBD1和LL37发挥着重要作用。以上结论提示我们,本课题发现的肺Ⅱ型上皮细胞发生自噬从而上调抗菌肽hBD1和LL37的活性肽水平,能够发挥抗结核功能,此为一种新发现的机体对抗MTB的机制。