研究背景狂犬病毒（Rabies virus）感染仍然是发展中国家严重的公共卫生威胁,新型且廉价的ELISA诊断抗原的开发对于该病的早期发现和预防至关重要。狂犬病病毒糖蛋白（glycoprotein,G）作为狂犬病毒的主要结构蛋白,其在诊断试剂盒开发、病毒感染性、免疫应答、疫苗研发等方面有着重要的研究价值。然而如何表达及纯化出具有天然结构的RABVG是目前阻碍其应用与研究的重要瓶颈。目的本课题研究的目的是建立能稳定表达分泌性胞外域RABV G的哺乳动物细胞系统,优化纯化方法,获得重组蛋白,为ELISA快速诊断试剂盒及新型亚单位疫苗的研发奠定基础。方法构建含RABV G胞外基因的重组慢病毒表达载体,转染HEK 293T细胞,收集 48h 细胞与上清进行Western Blot 鉴定。包装慢病毒（pLV-CMV-RABV-G-eGFP）,用收集得到的慢病毒 pLV-CMV-RABV-G-eGFP感染HEK 293T细胞,利用有限稀释法筛选高表达的重组单克隆细胞株并连续传代,用Western Blot和流式细胞术检测重组单克隆细胞株的稳定性。优化纯化条件,制备纯化RABV G,SDS-PAGE检测其纯度。BCA蛋白定量法测定纯化后蛋白的浓度。将纯化好的RABV G分别用Western Blot和ELISA方法进行抗原特异性鉴定,鉴定正确后用皮下多点注射方法免疫Balb/c小鼠,ELISA检测小鼠血清中抗G蛋白抗体的水平,荧光抗体中和实验测定小鼠血清中的中和抗体滴度。结果成功构建了胞外域RABV G重组慢病毒表达载体pLV-CMV-RABV-G-eGFP。Western Blot成功检测出RABV G能在293T细胞及上清中表达。慢病毒包装成功后感染HEK293T细胞,通过有限稀释法筛选得到6个重组单克隆细胞株。通过Western Blot检测筛选出RABV G表达量最高的单克隆细胞株并命名为HEK-293T-RABV-G-2。Western Blot及流式细胞术检测结果显示该重组细胞株连续传代至第40代,其RABV G分泌水平、荧光率和荧光强度均未发生显著改变。SDS-PAGE检测纯化得到的RABV G纯度超过95%。ELISA检测结果表明其OD值与中和抗体滴度成强的直线正相关关系。用纯化后的RABVG免疫Balb/c小鼠,能产生高水平的抗G蛋白抗体。荧光抗体中和实验结果显示,免疫小鼠血清中未检测到中和抗体的产生。结论本研究成功构建了含胞外域RABV G基因的重组慢病毒表达载体pLV-CMV-RABV-G-eGFP,筛选出能够稳定表达分泌性胞外域RABV G的重组HEK 293T单克隆细胞系HEK-293T-RABV-G-2。优化纯化条件后,获得高纯度以及高免疫原性的的重组RABV G。体内结果显示,重组RABV G能刺激小鼠机体产生高水平抗G蛋白抗体,却未能刺激小鼠产生保护性中和抗体。本研究为狂犬病血清学诊断方法的研发奠定了基础,也为进一步研发狂犬病毒新型亚单位疫苗提供了研究思路。