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泡沫病毒属反转录病毒科,具有广泛的宿主范围却至今未发现其致病性,是良好的基因转移载体骨架。在泡沫病毒感染的细胞中,许多并不发生形态上的变化,不能通过细胞病变效应(CPE)方法检测其感染状态。为此本文建立了一套可以简便、准确、敏感并快速的检测感染的方法。
利用BFV感染细胞后可以激活BFV的长末端重复序列LTR,在LTR下连入egfp基因的质粒转染BHK-21细胞。经过G418的筛选LTR-egfp稳定整合细胞株,经三次单克隆化,最终从48株阳性克隆中得到一株本底表达水平最低,在BFV感染后GFP得以高效表达的细胞,命名为BICL(BFVindicatorcellline)。
对于可以出现CPE的情况,通过观测BICL中GFP的表达情况,用TCID50的方法检测BFV的滴度:同传统的观测CPE的方法比较,BICL方法在感染后5-6天就可以检测到最终滴度,而CPE则需8-9天。同时,前者比后者灵敏度高出100倍。对于共培养和裂解液两种感染手段的比较表明,BICL与CPE方法测到的结果都表明共培养比裂解液中病毒滴度高1000倍。这说明BICL不仅结果可靠,而且比CPE的方法更加快速,灵敏。
对于CPE无法检测的病毒潜伏性感染,BICL中GFP表达可指示其感染。本文成功检测了BFV3026以及感染性质粒pCMV-BFV在HeLa和293T细胞中的感染情况,建立了基于BICL的检测体系。
利用BICL体系,本文跟踪了BFV3026在FBL细胞中的感染随时间的变化情况,同时对BFV的反转录发生时间及组织培养宿主范围进行了探讨。在反转录抑制实验中,BICL可灵敏的指示AZT对于BFV反转录的抑制作用,BFV的反转录过程发生于病毒感染生活周期的晚期。同时,在组织培养细胞宿主的研究中,BICL方法较传统方法更加精确指示了BFV在不同细胞中的感染状态。
综上本文成功地建立起一套可以灵敏,准确的检测BFV感染性的BICL检测体系。