血吸虫病依然是全球尤其是在发展中国家广泛流行的寄生虫病，目前全球约有2亿血吸虫病患者。在感染人的六种血吸虫中，日本血吸虫病具有人畜共患性，因此被认为是最难控制的血吸虫病。近年来，在我国南方部分省份血吸虫病出现了死灰复燃的趋势。因此，研制有效的血吸虫病疫苗对控制和预防血吸虫病显得尤为重要。　　血吸虫被膜覆盖于血吸虫虫体表面，是血吸虫外膜的重要组成部分，被膜在血吸虫的营养、免疫逃避与调节、排泄、渗透调节、感觉、信号转导等方面都具有重要功能，构成“宿主-寄生虫”接触表面。被膜上的蛋白也是血吸虫病疫苗的重要候选抗原，例如已经广泛研究的两种血吸虫病疫苗候选分子，Sm23和TSP2都定位在血吸虫被膜上。　　Sm29是最近鉴定的曼氏血吸虫被膜蛋白。该蛋白含有一个由26个氨基酸组成的信号肽和一个C-末端单跨膜结构。在小鼠攻击感染模型中，该蛋白已显示出良好的免疫保护效果。用该蛋白免疫小鼠能诱导小鼠产生强烈的Th1型免疫应答，IFN-γ，TNF-α以及IL-12等细胞因子水平显著增高，减虫率和肠减卵率可分别达到51％和60％，同时还能减少50％的肉芽肿。通过比较日本血吸虫转录组序列数据库，发现在日本血吸虫中也存在与Sm29高度同源的蛋白（定名为Sj29）。该蛋白除了序列与Sm29高度同源外，其序列长度、半胱氨酸数量和位置等与Sm29完全一致。　　Sj29蛋白通过生物信息学预测含有3个潜在的糖基化位点和8对二硫键。期表达特异性分析表明该蛋白只在日本血吸虫的肺期童虫及成虫阶段有转录。同时用抗Sj29血清检测血吸虫被膜，能在被膜中检测到该蛋白。Sj29富含半胱氨酸，为获得重组蛋白，本实验选择毕氏酵母分泌表达系统，该系统适合二硫键丰富的蛋白的表达，由此表达的蛋白在构象上更接近天然蛋白。首先，我们按照毕氏酵母偏好密码子，对Sj29编码序列进行优化，同时为防止表达产物过度糖基化，将三个糖基化位点进行突变，即将三个Asn-X-Ser/Thr(X是除Pro以外的任何氨基酸)序列中的天冬酰胺突变为谷氨酰胺(Gln);然后通过不对称PCR方法全合成该蛋白胞外区序列，将产生的Sj29合成基因转入毕氏酵母进行分泌表达，表达产物通过Ni-柱纯化后，得到纯度约95％的重组蛋白。用纯化的重组蛋白与ISA70M佐剂乳化进行小鼠免疫实验，结果显示:在第三次免疫后血清中抗Sj29特异性IgG抗体显著增高，抗体平均滴度达1∶1，580，000;与PBS/70M对照组比较，Sj29/70M实验组IFN-γ和TNF-α水平均明显升高，其中IFN-γ含量之比为2550pg/ml∶240pg/ml，TNF-α含量之比为1300 pg/ml∶230pg/ml，以上结果差异显著(p＜0.05);而IL-4含量实验组与对照组之比为150 pg/ml∶90pg/ml，两者无显著差异(p=0.18)。此外，流式细胞检测也发现，Sj29/70M实验组Th1细胞比例平均为7.78％，比PBS/70M对照组(3.72％)显著升高(p＜0.05)，而Th2细胞较PBS对照组无明显变化。以上结果提示Sj29免疫小鼠主要引起Th1型免疫反应。小鼠三次免疫后，每只攻击感染40±2条尾蚴，六周后处死小鼠，计算减虫率及减卵率，结果显示:Sj29/70M免疫组与PBS/70M对照组对比，其减虫率、肝减卵率和肠减卵率分别为25％(p＜0.05)，34％(p＜0.05)和42％(p＜0.05)，表明该蛋白能产生一定的免疫保护效果。　　抗原多态性被认为是影响疫苗保护效果的因素之一。通过对几个已知曼氏血吸虫抗原基因的多态性研究发现，一些疫苗候选抗原均存在抗原变异，如:Sm14有13个SNP位于编码区;Sm23有23个SNP位于编码区;GST有26个SNP位于编码区。因此，本研究的重点内容之一是探讨Sj29抗原多态性以及这种多态性对免疫保护作用的影响。本实验首先对日本血吸虫Sj29编码序列进行测序以鉴定SNPs。从小鼠体内分离单个血吸虫成虫，共计90条，抽提其总RNA，用RT-PCR获得cDNA，按两端保守序列设计引物进行PCR，获得单个虫体Sj29编码序列，克隆到pBlu2KSM载体后进行DNA测序，每个血吸虫样本共测序3个克隆，共计获得257个克隆的测序结果。序列比对后结果显示，在全长579bp的编码区中，共检测到89个碱基突变，这些突变均位于胞外段，其中A/G突变31个(34.83％)，C/T突变16个(17.98％)，A/C突变14个(15.73％)，A/T突变13个(14.61％)，G/T突变7个(7.87％)，G/C突变8个(8.99％)。有13个碱基突变位点为同义突变，其余均为错义突变，同义突变/错义突变为1∶5.2，提示该基因可能经历了自然正选择。进一步分析257个测序结果，根据序列变异特点以及在整个样本中的比例，可将Sj29基因分为三种主要变异类型（定名为a、b和c型），每种类型内95％以上氨基酸序列相同，三种主要类型占了所有样本的98％，还有2％的样本不能划入以上三种。　　本研究制备的用于免疫攻击感染实验的Sj29序列属于a型。我们用该型Sj29重组蛋白进行免疫，再用混合型（包括a、b和c型）尾蚴进行攻击感染。通过分析单个虫体的Sj29基因序列变异类型，计算各类型的频率，并与对照组比较，探讨该抗原的免疫保护作用是否与其序列变异（类型）相关。分析曼氏血吸虫和日本血吸虫基因组数据库表明Sm29或Sj29在基因组中是以单拷贝基因存在，因此血吸虫成虫只存在一对Sj29等位基因，当某血吸虫为杂合子时，用PCR产物直接测序，突变位点在测序图谱上将出现叠峰，而纯合子样本则为单峰。我们分析了Sj29/70M蛋白免疫组、PBS/70M佐剂对照组和PBS对照组共三个组中血吸虫单虫样本Sj29基因序列变异类型的差异，每组约90条血吸虫单虫。首先，比较PBS对照组与Sj29/70M实验组中样本变异类型，结果显示:两组中a纯合型样本(a/a型)的比例分别为10.47％和2.25％，a杂合型样本（a/b型+a/c型）分别为43.02％和37.08％，非a型样本(b/b型+b/c型+c/c型)分别为46.51％和60.67％，Pearson Chi-Square统计分析PBS对照组与Sj29/70M实验组中a纯合型、a杂合型和非a型的样本构成比，x2=6.719，p=0.035，差异显著。此外，基因频率分析表明，PBS对照组和实验组a型频率分别为31.98％和20.79％，b型频率分别为44.77％和53.93％，c型频率分别为23.26％和25.28％，PearsonChi-Square统计分析，x2=5.801，p=0.055。更重要的是，比较两组中的a纯合型样本的比例发现，Sj29/70M实验组a纯合型(a/a型)频率较对照组减少78.51％，a杂合型减少7.08％(a/b型)和29.71％（a/c型），非a型(b/b型、b/c型和c/c型)没有减少。同时，我们按照同样数据处理方法分析PBS对照组和PBS/70M佐剂组。Pearson Chi-Square统计分析PBS对照组和70M佐剂组中a纯合型、a杂合型和非a型的样本构成比表明，x2=0.528，p=0.768;分析两组中a型，b型和c型基因频率构成比表明，x2=0.581，p=0.748;同时，70M佐剂组中a纯合型或a杂合型样本频率与PBS对照组比较也没有减少。以上结果提示，Sj29诱导的免疫保护力主要针对同类型的虫体发挥作用。　　总之，本研究通过基因全合成，在毕氏酵母表达制备了日本血吸虫Sj29重组蛋白，并在小鼠模型中进行免疫和攻击感染的实验研究，结果显示了Sj29抗原能诱导Th1型免疫应答，攻击感染的免疫保护效力为25％的减虫率，34％的肝脏虫卵减卵率和42％的肠虫卵减卵率;本研究重点研究了Sj29抗原多态性及其与免疫保护作用的相关性。结果提示，Sj29免疫保护作用具有变异类型特异性，对同一变异类型的虫体，尤其是纯合子，具有很高的免疫保护作用，但对不同变异类型的虫体几乎无保护作用。本研究结果建议，以Sj29被膜蛋白为基础的血吸虫病疫苗需要将各种变异类型的序列联合，以提高疫苗的免疫保护效果。