日本血吸虫病(Schistosomiasis japonicum)是由日本血吸虫(Schistosome japonicum)感染引起的一种严重危害人畜健康的寄生虫病。在日本血吸虫完成其生活史的过程中,尾蚴侵入宿主后脱去其单层外质膜形成具有双层外质膜的体被被膜。作为日本血吸虫和宿主相互作用的主要界面,伴随着其表膜蛋白不断合成和降解,体被被膜不停地更新,不同发育阶段虫体体被结构发生了明显的改变,从而使日本血吸虫能适应寄生生活,在宿主体内完成其生活史。本研究利用蛋白质组学shotgun技术系统分离、分析不同发育时期日本血吸虫体被表膜蛋白,为探索血吸虫的免疫逃避机制及其与宿主的相互作用关系,进而为筛选疫苗候选分子、诊断抗原和药物靶标提供基础。同时,对日本血吸虫一体被表膜蛋白磷酸二酯酶-5(SjNPP-5)编码基因进行了克隆、表达及初步的免疫保护效果评估,为深入开展该基因的生物学功能研究创造了条件。1.日本血吸虫体被表膜蛋白分离与初步分析本研究收集了感染新西兰白兔的8 d、11 d、14 d、17 d、20 d、23 d、26 d、29 d、32 d、42 d-合抱期成虫、42 d-雌虫以及42 d-雄虫共12个时期的日本血吸虫虫体,应用非渗透性生物素Sulfo-NHS-SS-Biotin标记虫体的体被表膜蛋白,利用链酶亲和素-生物素系统提取、纯化各个时期的虫体体被表膜蛋白,经SDS-PAGE电泳初步分离,毛细管反相高效液相色谱法(RP-HPLC)进一步分离,再使用串联质谱对各期虫体体被表膜蛋白进行分析鉴定。初步结果分别从8 d、11 d、14 d、17 d、20 d、23 d、26 d、29 d、32 d、42 d-合抱期成虫、42 d-雌虫以及42 d-雄虫虫体中分离、鉴定到475个、347个、263个、165个、250个、337个、298个、140个、114个、85个、202个和331个体被表膜蛋白。初步分析表明在已被鉴定、生物学功能明确的体被表膜蛋白中,有不少是血吸虫的重要功能分子,在血吸虫营养摄取、信号传导及逃避宿主免疫应答中具有重要作用,如23 KD膜蛋白、四跨膜蛋白(TSP)、29 KD膜蛋白、膜磷脂结合蛋白(Annexin)等膜蛋白,β-TGF受体、14-3-3、Na+/K+离子通道蛋白等信号传导和信号通道相关分子,葡萄糖转运蛋白(SGTP)、烯醇酶(Enolase)、磷酸二酯酶-5(NPP-5)、3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)等与营养摄取、代谢等相关的分子,肌动蛋白(Actin)、副肌球蛋白(Paramyosin)等结构蛋白,及IgG和IgM抗体重链,C3补体分子等与宿主同源的蛋白。对这些蛋白的深入分析、鉴定工作仍在进行。本研究对多个不同发育阶段的日本血吸虫虫体的体被表膜蛋白进行系统地分离、分析,研究成果对分离、鉴定与日本血吸虫营养摄取、免疫逃避、信号传导等相关的重要功能分子,探讨血吸虫的生长发育机制及血吸虫与宿主的相互作用关系,进而对疫苗候选分子、诊断抗原和药物靶标的筛选都具有重要意义。2.日本血吸虫体被表膜蛋白磷酸二酯酶-5(SjNPP-5)的研究在不同发育时期日本血吸虫体被表膜蛋白质谱分析的基础上,挑选出一体被表膜蛋白磷酸二酯酶-5(SjNPP-5,CAX72650.1)进行深入研究。NPP-5为膜外核苷酸焦磷酸酯酶/磷酸二酯酶家族(NPPs)的一个成员,该家族为具有相同保守结构的外膜蛋白,都具有水解膜外核苷酸、磷脂、胆碱磷酸酯的焦磷酸酯键/磷酸二酯键而释放5’ -核苷单磷酸的活性,该活性被称为NPP活性。该蛋白是在日本血吸虫多个发育时期虫体体被不断更新过程中出现的,在血吸虫寄生生活中可能起着重要作用。本研究利用PCR扩增获得SjNPP-5的全长cDNA序列,其ORF为1371 bp,编码456个氨基酸,理论分子量为52245.13 Da,理论等电点为8.37。成功构建了pET32a(+)-SjNPP-5重组表达质粒,在大肠杆菌中以包涵体的形式表达,分子量为69 kDa。Real-time RT-PCR分析表明该基因在21 d-42 d虫体中转录水平高于7 d和14 d,在42 d雄虫中的转录水平远高于42 d雌虫,为后者的10倍。Western blotting分析表明pET32a(+)-SjNPP-5重组蛋白具有较好的抗原性和免疫原性。免疫荧光实验结果显示SjNPP-5主要表达于日本血吸虫各个时期的虫体被膜上。用纯化的pET32a(+)-SjNPP-5重组蛋白结合206佐剂免疫BALB/c小鼠,与空白对照组相比,免疫小鼠获得了29.90%的减虫率(P<0.05)和26.21%的肝脏减卵率(P>0.05)。ELISA表明第一次免疫后抗重组蛋白特异性IgG抗体迅速产生,且一直维持在一个较高的水平。免疫保护机制研究表明,应用重组抗原三次免疫后,免疫鼠血清中特异性的IgG1和IgG2a抗体水平都持续升高,但IgG1/IgG2a比值呈下降趋势,同时,第三次免疫后小鼠血清中IFN-γ和IL-4都显著性升高,说明rSjNPP-5免疫小鼠后诱导了Th1/Th2混合型免疫应答但以Th1型占主导。本研究表明SjNPP-5可能在日本血吸虫的生长发育过程中起着重要作用。综上,针对体被表膜蛋白在血吸虫生长发育中具有重要作用,本研究对日本血吸虫不同发育时期童虫和成虫的体被表膜蛋白进行系统地分离和分析,发现了一批具有重要生物学功能的血吸虫体被表膜蛋白分子。对日本血吸虫体被表膜蛋白SjNPP-5编码基因进行了克隆、表达及对其在小鼠体内诱导的免疫保护效果进行评估。本文对深入探讨日本血吸虫的生长发育机制及血吸虫与宿主相互作用关系,筛选血吸虫疫苗候选分子、诊断抗原和药物靶标提供了重要基础。