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喹赛多是喹噁啉类化合物饲料添加剂,兼有抑菌及促生长功效,且安全低毒、用药后迅速吸收及消除、残留期短、无蓄积,在畜牧生产中具有良好的应用潜力。本实验室通过连续亲和层析实验和生物质谱技术初步筛选出喹赛多在人正常肝细胞HL-7702(L-02)内的特异结合蛋白为核内不均一核糖核蛋白A2/B1(hnRNP A2/B1),并且用分子对接软件预测出它们之间的结合位点为Lys(101)、Arg(102)和Ala(105)。但是喹赛多与hnRNP A2/B1的具体相互作用及它们结合后引起的生物学效应并没有得到确证和研究,而喹赛多与靶蛋白之间作用位点、亲和力的研究对于弄清楚其药理机制具有重要的意义。本课题将通过体外重组表达hnRNP A2/B1蛋白及其突变蛋白,进行表面等离子体共振实验(SPR),研究喹赛多与hnRNP A2/B1之间的结合特性,并通过RNA干扰实验(RNAi)研究hnRNP A2/B1对喹赛多调节细胞内增殖相关基因表达的影响,分析喹赛多促生长的作用机理。1喹赛多与hnRNP A2/B1的相互作用针对分子对接中预测的喹赛多与hnRNP A2/B1的3个结合位点,Lys(101)、Arg(102)和Ala(105),根据氨基酸定点突变原则分别将其突变为Ala(101)、Ala(102)和Gly(105)。构建原核表达质粒pET28a-hnRNP A2/B1、Lys101Ala、Arg102Ala、Ala105Gly,通过大肠杆菌体外大量表达目的蛋白,利用His-tag亲和Ni柱纯化目的蛋白并用Western blot技术验证后,与喹赛多进行SPR实验。通过多循环方法检测到喹赛多与hnRNP A2/B1及突变蛋白R(R101A)和A(A102G)都能结合,具有浓度依赖性。同时喹赛多与野生型hnRNP A2/B1的亲和力要强于突变蛋白,因此Arg(102)对其结合有一定的影响,而对Lys(101)进行突变后蛋白与喹赛多完全失去相互作用,说明Lys(101)直接参与了喹赛多与hnRNP A2/B1的结合,是一个关键的结合位点。2喹赛多作用L-02细胞产生的生物学效应通过RNAi实验抑制L-02细胞内的hnRNP A2/B1后,用实时荧光定量qRT-PCR检测喹赛多作用前后hnRNP A2/B1、mki-67、c-myc、ccnd2、p21 mRNA的表达变化。结果发现将L-02细胞内hnRNP A2/B1干扰后5种基因的mRNA表达水平均有显著性下调,说明在L-02细胞内这4种基因与hnRNP A2/B1关系密切。同时,使用2mM喹赛多孵育L-02细胞1h后,空白加药组与干扰加药组之间各基因表达相比均有显著性差异,说明hnRNP A2/B1对喹赛多调节下游基因有重要的作用。结合SPR实验结果喹赛多在体外能直接与hnRNP A2/B1结合,推测喹赛多在L-02细胞内也很有可能通过与hnRNP A2/B1结合产生效应。用2mM喹赛多孵育L-02细胞1h后,通过qRT-PCR检测到hnRNP A2/B1、mki-67、c-myc、ccnd2、p21的mRNA水平均有显著性的上调,可以推测喹赛多作用于L-02细胞后,与细胞生长和增殖密切相关的mki-67和c-myc的mRNA水平随着hnRNP A2/B1的上调而上调,随着时间的延长,与细胞周期及凋亡相关的ccnd2及p21等基因出现了负反馈调节,控制细胞生长的速度。综上所述,本课题通过SPR和RNAi实验研究了喹赛多与hnRNP A2/B1的相互作用和喹赛多作用细胞后引起的生物学效应,发现hnRNP A2/B1在体外能与喹赛多直接结合,且Lys(101)是其相互作用中的关键结合位点,Arg(102)则对hnRNP A2/B1与喹赛多的结合有一定的影响。喹赛多作用于L-02细胞后,与细胞生长和增殖密切相关的mki-67和c-myc的mRNA水平随着hnRNP A2/B1的上调而上调,可能使细胞增殖加快。同时为了保持细胞内的动态平衡,避免出现异常的过度增殖,与细胞周期及细胞凋亡相关的ccnd2及p21基因出现了负反馈调节,减缓细胞增殖的速度。因此,喹赛多作用于L-02细胞后很有可能与hnRNP A2/B1相结合激活下游通路,通过调节与细胞生长、增殖、凋亡相关基因的表达发挥促生长作用。