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目的:本研究通过中药网络药理学的方法探讨黄芪四君子汤对于大鼠肝癌的影响机制,并通过动物实验研究来进一步验证。
方法:
1.采用中药网络药理学的分析黄芪四君子汤对肝癌的潜在影响步骤如下:通过TCMSP数据库分别查询黄芪、人参、白术、茯苓和甘草有效成分。黄芪四君子汤按设定条件后筛选出中药—成分,成分—靶点,然后形成一个中药—成分—靶点的网络。然后再将对应的靶点在UniProt数据库中转换成对应的GeneName。在NCBIGene数据库,以“livercancer”和“homosapiens”为关键词检索肝癌相关基因。运用R语言将全部检索得出的有效成分对应的相关靶点基因和人类肝癌基因进行对比,得出一个黄芪四君子汤—肝癌之间的交互图。然后将交集的基因运用STRING数据库对得进行分析,得出蛋白—蛋白互作网络图。将得出交互基因再运用R语言进行KEGG富集分析。
2.动物实验:雄性SD大鼠40只,适应喂养入实验,随机分为空白组、模型组、黄芪四君子汤小剂量组、大剂量组。空白组和中药组采用腹腔注射DEN(二乙基亚硝胺)诱导大鼠肝癌病变的模型。黄芪四君子汤大剂量组以2mg/ml、小剂量组以1mg/ml,按0.1ml/10g剂量进行灌胃,1次/日,至16周;实验过程中每周测大鼠体重一次。处死大鼠进行称重,腹主动脉采血,取出肝脏、脾脏,观察大鼠一般情况、存活率、体重,肝脏指数、脾脏指数、肝功能指标AST、ALT、GGT的变化;HE染色观察病理学改变;免疫组化检测VEGF的表达。
结果:
1.中药网络药理学分析结果:TCMSP数据库检索得出:黄芪四君子汤共计有效成分156个。其中黄芪20个,人参22个,白术7个,茯苓15个,甘草92个。检索相关靶点基因1739个,其中黄芪361个,人参197个,白术18个,茯苓22个,甘草1241个。检索NCBIGene数据库共得到关于肝癌基因412个。将中药靶点基因与肝癌基因之间进行交互,共有41个交集基因。将黄芪四君子汤与肝癌基因之间交集的41个基因在STRING数据库中进行蛋白—蛋白互作。通过R语言分析共得出相关通路分析123条,排除宽泛分析,得出信号通路前9个,P值越小表明富集越高。结果显示黄芪四君子汤可通过VEGF信号通路、AMPK信号通路、Hedgehog信号通路、MAPK信号通路、p53信号通路、TNF信号通路、Ras信号通路、IL-17信号通路、JAK-STAT信号通路等影响肝癌变化进程。其中VEGF信号通路富集最高,说明在肝癌中属于高表达。
2.动物实验结果:黄芪四君子汤对DEN诱导的肝癌大鼠模型的生存率具有明显的提高作用,模型组和黄芪四君子汤小剂量组、大剂量的生存率分别为60%、80%、100%,各组之间对比有统计学意义(P<0.05)。各组大鼠体重均呈增加趋势,与模型组相比,黄芪四君子汤大剂量组的大鼠体重明显高于模型组(P<0.01)。模型组相对于黄芪四君子汤小剂量组大鼠体重变化也具有差异性(P<0.05)。黄芪四君子汤对大鼠肝脏指数、脾脏指数的影响中,其中以脾脏指数影响最为明显,黄芪四君子汤大剂量组、小剂量组与模型组对比肝脏指数、脾脏指数均具有差异性(P<0.05)。大鼠的肝功能检测显示具有明显的改善:与空白组比较,模型组大鼠的ALT、AST、GGT均升高明显,肝功能明显下降;黄芪四君子汤大剂量和小剂量组与模型组对比,ALT、AST、GGT具有统计学差异(P<0.05)。在VEGF表达方面,与空白组比较,模型组VEGF呈高阳性表达;与模型组比较,黄芪四君子汤大剂量与小剂量组中明显具有抑制作用,且大剂量的抑制更明显,两者有显著差异(P<0.05)。
结论:
1.运用中药网络药理学分析得出黄芪四君子汤基因靶点与肝癌共有41个交集基因,其具有复杂的作用网络,富集分析得出的黄芪四君子汤可作用于VEGF信号通路等多种信号通路来调控肝癌的进展,起到了关键作用。
2.动物实验证实黄芪四君子汤可明显改善大鼠的生存能力,改善其肝功能,增强其免疫力,并可通过VEGF信号通路抑制肝癌的增殖。
方法:
1.采用中药网络药理学的分析黄芪四君子汤对肝癌的潜在影响步骤如下:通过TCMSP数据库分别查询黄芪、人参、白术、茯苓和甘草有效成分。黄芪四君子汤按设定条件后筛选出中药—成分,成分—靶点,然后形成一个中药—成分—靶点的网络。然后再将对应的靶点在UniProt数据库中转换成对应的GeneName。在NCBIGene数据库,以“livercancer”和“homosapiens”为关键词检索肝癌相关基因。运用R语言将全部检索得出的有效成分对应的相关靶点基因和人类肝癌基因进行对比,得出一个黄芪四君子汤—肝癌之间的交互图。然后将交集的基因运用STRING数据库对得进行分析,得出蛋白—蛋白互作网络图。将得出交互基因再运用R语言进行KEGG富集分析。
2.动物实验:雄性SD大鼠40只,适应喂养入实验,随机分为空白组、模型组、黄芪四君子汤小剂量组、大剂量组。空白组和中药组采用腹腔注射DEN(二乙基亚硝胺)诱导大鼠肝癌病变的模型。黄芪四君子汤大剂量组以2mg/ml、小剂量组以1mg/ml,按0.1ml/10g剂量进行灌胃,1次/日,至16周;实验过程中每周测大鼠体重一次。处死大鼠进行称重,腹主动脉采血,取出肝脏、脾脏,观察大鼠一般情况、存活率、体重,肝脏指数、脾脏指数、肝功能指标AST、ALT、GGT的变化;HE染色观察病理学改变;免疫组化检测VEGF的表达。
结果:
1.中药网络药理学分析结果:TCMSP数据库检索得出:黄芪四君子汤共计有效成分156个。其中黄芪20个,人参22个,白术7个,茯苓15个,甘草92个。检索相关靶点基因1739个,其中黄芪361个,人参197个,白术18个,茯苓22个,甘草1241个。检索NCBIGene数据库共得到关于肝癌基因412个。将中药靶点基因与肝癌基因之间进行交互,共有41个交集基因。将黄芪四君子汤与肝癌基因之间交集的41个基因在STRING数据库中进行蛋白—蛋白互作。通过R语言分析共得出相关通路分析123条,排除宽泛分析,得出信号通路前9个,P值越小表明富集越高。结果显示黄芪四君子汤可通过VEGF信号通路、AMPK信号通路、Hedgehog信号通路、MAPK信号通路、p53信号通路、TNF信号通路、Ras信号通路、IL-17信号通路、JAK-STAT信号通路等影响肝癌变化进程。其中VEGF信号通路富集最高,说明在肝癌中属于高表达。
2.动物实验结果:黄芪四君子汤对DEN诱导的肝癌大鼠模型的生存率具有明显的提高作用,模型组和黄芪四君子汤小剂量组、大剂量的生存率分别为60%、80%、100%,各组之间对比有统计学意义(P<0.05)。各组大鼠体重均呈增加趋势,与模型组相比,黄芪四君子汤大剂量组的大鼠体重明显高于模型组(P<0.01)。模型组相对于黄芪四君子汤小剂量组大鼠体重变化也具有差异性(P<0.05)。黄芪四君子汤对大鼠肝脏指数、脾脏指数的影响中,其中以脾脏指数影响最为明显,黄芪四君子汤大剂量组、小剂量组与模型组对比肝脏指数、脾脏指数均具有差异性(P<0.05)。大鼠的肝功能检测显示具有明显的改善:与空白组比较,模型组大鼠的ALT、AST、GGT均升高明显,肝功能明显下降;黄芪四君子汤大剂量和小剂量组与模型组对比,ALT、AST、GGT具有统计学差异(P<0.05)。在VEGF表达方面,与空白组比较,模型组VEGF呈高阳性表达;与模型组比较,黄芪四君子汤大剂量与小剂量组中明显具有抑制作用,且大剂量的抑制更明显,两者有显著差异(P<0.05)。
结论:
1.运用中药网络药理学分析得出黄芪四君子汤基因靶点与肝癌共有41个交集基因,其具有复杂的作用网络,富集分析得出的黄芪四君子汤可作用于VEGF信号通路等多种信号通路来调控肝癌的进展,起到了关键作用。
2.动物实验证实黄芪四君子汤可明显改善大鼠的生存能力,改善其肝功能,增强其免疫力,并可通过VEGF信号通路抑制肝癌的增殖。