具有梯度结构的生物材料能够更好地模拟天然组织,在组织仿生修复方面起着至关重要的作用,是组织工程较理想的基质材料。梯度信号的引入常需要特殊的设备和复杂的工艺,制备具有多梯度结构的生物材料仍面临巨大的挑战。目的本研究以高晶丝蛋白纳米纤维为驱动模块,在交联和电场的共同作用下制备丝蛋白凝胶,实现力学和取向信号的连续梯度变化,并以高晶丝蛋白纳米纤维为载体丰富梯度信号的设计,建立普适性的多梯度凝胶制备方法。以骨-软骨界面力学信号的连续梯度变化为研究对象,制备具有仿骨-软骨界面力学信号的丝蛋白凝胶,实现对骨-软骨分化程度的连续梯度调控,为骨软骨等组织界面的仿生设计提供新的材料支持。方法1.利用丝蛋白溶液中高晶丝蛋白纳米纤维(BSNF)和非晶丝蛋白纳米纤维(ASNF)的不同特性,以BSNF为驱动模块,ASNF为凝胶基质,在交联和电场作用下制备丝蛋白多梯度凝胶(GSNF)。通过力学性能、二级结构和微观形貌等方面的表征,探索GSNF凝胶中多相梯度的分布特点和形成机制。利用ASNF/BSNF混合比例和酶交联时间等因素调整溶液-凝胶的粘度,实现对GSNF凝胶梯度结构的有效控制。以小分子药物罗丹明为模型药物加载于BSNF驱动模块,制备具有罗丹明梯度的凝胶,探讨小分子药物在GSNF凝胶中的分布特点。进一步引入甲基丙烯酸酐化明胶(Gel MA)和N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM)作为ASNF凝胶的替代基质,从力学性能和二级结构上表征及验证梯度信号形成的普适性,为基于丝蛋白纳米纤维的多梯度凝胶体系的构建提供材料支持。2.制备具备骨-软骨力学诱导信号梯度变化的水凝胶,通过骨髓间充质干细胞(BMSCs)体外实验,从细胞粘附、增殖和骨软骨诱导性能等方面进行研究,探讨GSNF凝胶对细胞粘附、增殖和骨软骨分化诱导行为的影响,以及是否具有调控细胞行为梯度变化的能力。3.通过大鼠皮下包埋实验,从生物相容性、降解性和异位成骨软骨能力等方面对具备骨-软骨力学诱导信号梯度变化的水凝胶进行评估,探讨GSNF凝胶在动物体内的生物相容性、降解性和异位生成骨软骨能力,评估材料梯度信号主动诱导骨-软骨形成的能力,为未来骨-软骨界面组织的修复提供指导。结果1.以BSNF为驱动模块,通过交联和电场的共同作用,成功实现BSNF驱动模块在凝胶体系中的梯度分布,进而完成GSNF凝胶中多个梯度信号的引入。通过调节溶液混合比例和交联时间等因素改变溶液粘度,实现了BSNF驱动模块梯度分布的精细化调控,证明了GSNF凝胶中力学梯度的高度可调性。与此同时,在电场作用下,GSNF取向排列在力学信号梯度的基础上赋予凝胶取向梯度,制备出具有多种梯度信号的丝蛋白基凝胶。通过小分子药物罗丹明的引入,在现有力学和取向梯度信号基础上能够实现活性成分的梯度加载,验证了以BSNF驱动模块实现丰富信号梯度引入的可行性。随后将BSNF作为梯度信号的载体,引入到Gel MA和NIPAM等不同凝胶体系,同样实现了梯度凝胶的制备,证明了以BSNF驱动模块制备梯度凝胶的普适性。2.GSNF凝胶具有良好的组织粘附性和细胞相容性,多相梯度的存在不仅能够调控细胞的粘附和铺展行为,同时可诱导增殖细胞的规则排列和分布。体外骨软骨分化结果显示随着凝胶力学强度的增加,骨分化诱导性能呈梯度增强的趋势,软骨分化呈先增强后减弱的趋势,说明GSNF凝胶在体外具有诱导骨软骨分化并呈梯度变化的能力。3.GSNF凝胶具有优异的组织相容性和可调的降解性,体内降解时间与凝胶强度有关,强度越高降解速度越慢,可为损伤部位的再生修复提供充足时间。GSNF凝胶可诱导周围和内部组织的取向生长,有利于损伤组织的取向修复。体内异位成骨软骨结果显示随着凝胶强度的增加,异位成骨能力呈梯度增强的趋势,异位成软骨能力呈先增强后减弱的趋势,说明GSNF凝胶在体内具有诱导异位骨软骨生成并呈梯度变化的能力,类似于天然骨软骨梯度结构,可为骨软骨等复杂组织界面的修复提供新的材料支持。结论以丝蛋白高晶纳米纤维为驱动模块,成功实现具有丰富连续梯度信号水凝胶的可控制备和设计,建立了具有高度普适性和可调控性的梯度凝胶制备方法。力学、取向以及生物活性分子等不同梯度信号成功引入凝胶体系,并通过粘度调控等实现信号梯度强度的控制。以骨软骨界面为目标,制备出能够梯度诱导骨-软骨分化程度的丝蛋白凝胶,验证了通过连续梯度信号的引入改善骨软骨等复杂组织界面的修复质量的可行性。