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赤拟谷盗(Tribolium castaneum)是一种世界性的储粮害虫，磷化氢作为一种性能优良的粮食熏蒸剂，在世界范围内被长期广泛应用。由于赤拟谷盗的磷化氢抗性日益增强，严重影响储粮害虫治理和储粮综合管理。细胞色素P450酶系是参与杀虫剂抗性形成的重要代谢酶系，转录组分析表明，赤拟谷盗多个P450基因同磷化氢抗性存在联系，其中CYP4C1、CYP4Q1、CYP4Q4和CYP4Q7基因在抗性种群中过表达，但是其在抗性形成中的具体作用尚属未知，因此阐明CYP4C1、CYP4Q1、CYP4Q4和CYP4Q7的基因表达情况和基因功能是深入探究赤拟谷盗磷化氢抗性形成机制的分子基础，对实现害虫磷化氢抗性延缓和治理有重要意义。本文以不同磷化氢抗性水平的赤拟谷盗为研究对象，综合利用分子生物学方法探明赤拟谷盗CYP4C1、CYP4Q1、CYP4Q4和CYP4Q7基因与磷化氢抗性之间的关系，相关研究结果可以为储粮害虫抗药性监测和治理提供理论数据：
1.基于赤拟谷盗转录组的数据库信息，获得CYP4基因家族的CYP4C1、CYP4Q1、CYP4Q4和CYP4Q7这4个基因的序列，这4个基因的ORF为1476bp~1530bp，其编码的氨基酸为491~509个，预测分子量范围为56.43~59.31kD，理论等电点在8.20~8.91之间。通过在线TMHMM、ExPASy等软件分析表明，CYP4Q1和CYP4Q7基因编码的蛋白质有跨膜结构，而CYP4C1和CYP4Q4基因编码的蛋白质无跨膜结构。通过对结构域的分析发现，这4个基因编码的氨基酸均有细胞色素P450的5个重要保守区域的序列。
2.采用实时荧光定量PCR技术，对赤拟谷盗CYP4C1、CYP4Q1、CYP4Q4和CYP4Q7这4个基因的龄期和组织表达情况进行分析。结果表明，在幼虫阶段，CYP4C1、CYP4Q4和CYP4Q7基因在5龄幼虫(L5)中的表达量最高，分别为1龄幼虫(L1)的9.63倍、33.91倍和381.71倍，CYP4Q1基因则在3龄幼虫(L3)中的表达量最高，为1龄幼虫(L1)的38.58倍。在蛹期，这4个基因的表达量均在蛹阶段的中后期(P4)达到峰值，其中CYP4C1和CYP4Q4基因分别为最低值预蛹期(PP)的29.81倍和24.23倍，CYP4Q1基因是最低表达时期蛹末期(P5)时的4.68倍，CYP4Q7基因的表达量则是最低表达时期蛹前期(P1)的5.53倍。组织表达分析表明，4个基因均在肠中高表达，在脂肪体和马氏管中表达量次之，在除去这些组织器官后，4个基因在头部其余组织、胸部其余组织、腹部其余组织以及翅和足等五个组织或器官中的表达量较低，且相互间差异较小(P＞0.05)。
3.对赤拟谷盗不同磷化氢抗性种群的4个P450基因表达量进行研究，结果表明，随磷化氢抗性水平增加，表达量显著提高，其中，抗性种群CYP4C1、
CYP4Q4和CYP4Q7基因的表达量能分别达到敏感种群的9.44倍、4.81倍和11.36倍。然而CYP4Q1基因的表达量与敏感种群无显著性差异(P＞0.05)。在磷化氢胁迫处理后，CYP4C1、CYP4Q4和CYP4Q7基因的表达量显著上调，其中CYP4C1基因和CYP4Q4基因在利用磷化氢处理敏感种群6h后表达量达到峰值，在抗性种群中则在处理20h后表达量最高，而CYP4Q7基因的表达量在敏感种群磷化氢处理20h后达到峰值，在抗性种群中的变化趋势同CYP4C1基因和CYP4Q4基因几乎一致。另外，CYP4Q1基因在磷化氢胁迫处理后的变化不显著(P＞0.05)。由此推测，CYP4C1、CYP4Q4和CYP4Q7基因可能具体参与了赤拟谷盗的磷化氢抗性形成。
4.为进一步证实CYP4C1、CYP4Q1、CYP4Q4和CYP4Q7基因在赤拟谷盗磷化氢抗性过程中的作用，利用基因沉默(RNAi)技术对靶标基因进行了功能验证。结果表明，在分别注射靶向目的基因的双链RNA(dsRNA)后，敏感种群和抗性种群体内的对应标靶基因被成功沉默，沉默效率为70.32%~80.36%。同时对靶标基因沉默后的赤拟谷盗试虫进行了磷化氢敏感性测定，结果表明，在CYP4C1、CYP4Q4和CYP4Q7基因表达分别抑制后，敏感种群和抗性种群对磷化氢的敏感性均有所增加，其中敏感种群的死亡率从33.88%增加到70.53%~75.64%，抗性种群的死亡率则由32.69%上升至64.33%~70.68%。在对CYP4Q1基因进行RNA干扰后，敏感种群和抗性种群的死亡率没有显著变化(P＞0.05)。研究结果表明，CYP4C1、CYP4Q4和CYP4Q7基因可能参与了赤拟谷盗磷化氢抗药性的形成。
1.基于赤拟谷盗转录组的数据库信息，获得CYP4基因家族的CYP4C1、CYP4Q1、CYP4Q4和CYP4Q7这4个基因的序列，这4个基因的ORF为1476bp~1530bp，其编码的氨基酸为491~509个，预测分子量范围为56.43~59.31kD，理论等电点在8.20~8.91之间。通过在线TMHMM、ExPASy等软件分析表明，CYP4Q1和CYP4Q7基因编码的蛋白质有跨膜结构，而CYP4C1和CYP4Q4基因编码的蛋白质无跨膜结构。通过对结构域的分析发现，这4个基因编码的氨基酸均有细胞色素P450的5个重要保守区域的序列。
2.采用实时荧光定量PCR技术，对赤拟谷盗CYP4C1、CYP4Q1、CYP4Q4和CYP4Q7这4个基因的龄期和组织表达情况进行分析。结果表明，在幼虫阶段，CYP4C1、CYP4Q4和CYP4Q7基因在5龄幼虫(L5)中的表达量最高，分别为1龄幼虫(L1)的9.63倍、33.91倍和381.71倍，CYP4Q1基因则在3龄幼虫(L3)中的表达量最高，为1龄幼虫(L1)的38.58倍。在蛹期，这4个基因的表达量均在蛹阶段的中后期(P4)达到峰值，其中CYP4C1和CYP4Q4基因分别为最低值预蛹期(PP)的29.81倍和24.23倍，CYP4Q1基因是最低表达时期蛹末期(P5)时的4.68倍，CYP4Q7基因的表达量则是最低表达时期蛹前期(P1)的5.53倍。组织表达分析表明，4个基因均在肠中高表达，在脂肪体和马氏管中表达量次之，在除去这些组织器官后，4个基因在头部其余组织、胸部其余组织、腹部其余组织以及翅和足等五个组织或器官中的表达量较低，且相互间差异较小(P＞0.05)。
3.对赤拟谷盗不同磷化氢抗性种群的4个P450基因表达量进行研究，结果表明，随磷化氢抗性水平增加，表达量显著提高，其中，抗性种群CYP4C1、
CYP4Q4和CYP4Q7基因的表达量能分别达到敏感种群的9.44倍、4.81倍和11.36倍。然而CYP4Q1基因的表达量与敏感种群无显著性差异(P＞0.05)。在磷化氢胁迫处理后，CYP4C1、CYP4Q4和CYP4Q7基因的表达量显著上调，其中CYP4C1基因和CYP4Q4基因在利用磷化氢处理敏感种群6h后表达量达到峰值，在抗性种群中则在处理20h后表达量最高，而CYP4Q7基因的表达量在敏感种群磷化氢处理20h后达到峰值，在抗性种群中的变化趋势同CYP4C1基因和CYP4Q4基因几乎一致。另外，CYP4Q1基因在磷化氢胁迫处理后的变化不显著(P＞0.05)。由此推测，CYP4C1、CYP4Q4和CYP4Q7基因可能具体参与了赤拟谷盗的磷化氢抗性形成。
4.为进一步证实CYP4C1、CYP4Q1、CYP4Q4和CYP4Q7基因在赤拟谷盗磷化氢抗性过程中的作用，利用基因沉默(RNAi)技术对靶标基因进行了功能验证。结果表明，在分别注射靶向目的基因的双链RNA(dsRNA)后，敏感种群和抗性种群体内的对应标靶基因被成功沉默，沉默效率为70.32%~80.36%。同时对靶标基因沉默后的赤拟谷盗试虫进行了磷化氢敏感性测定，结果表明，在CYP4C1、CYP4Q4和CYP4Q7基因表达分别抑制后，敏感种群和抗性种群对磷化氢的敏感性均有所增加，其中敏感种群的死亡率从33.88%增加到70.53%~75.64%，抗性种群的死亡率则由32.69%上升至64.33%~70.68%。在对CYP4Q1基因进行RNA干扰后，敏感种群和抗性种群的死亡率没有显著变化(P＞0.05)。研究结果表明，CYP4C1、CYP4Q4和CYP4Q7基因可能参与了赤拟谷盗磷化氢抗药性的形成。