论文部分内容阅读
背景和目的:铁死亡是一种铁依赖的调节性细胞死亡（Regulated Cell Death,RCD）的新方式,与细胞坏死、凋亡、自噬及焦亡等存在明显差异,其特征是细胞内铁代谢异常和氧化还原系统失调导致的细胞内脂质过氧化物以及活性氧（Reactive Oxygen Species,ROS）的大量堆积。目前,在保证正常细胞存活的前提下激活肿瘤细胞的RCD是癌症治疗的前沿研究领域之一。诱导肿瘤细胞铁死亡很有可能成为一种有效且新颖的肿瘤治疗策略。原发性肝癌是全球第三大癌症相关致死病因。根据病理学分类,原发性肝癌可分为肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma,HCC）、肝内胆管细胞癌（Intrahepatic Cholangiocarcinoma,ICC）和混合型肝癌。我国是肝癌大国,患者5年总体生存率低,预后较差。肝癌起病隐匿,缺乏特异性早期标志物,很多患者一经确诊即为晚期,失去了根治性治疗的机会。肝癌被认为是异质性最高的恶性肿瘤之一,其基因变异谱范围广,至今没有发现明确的特征性变异,导致当前可用于晚期肝癌的治疗方法非常有限。肝癌基因组不稳定且异质性高是其抗肿瘤治疗效果不佳的主要原因之一。类器官技术是近年新兴的一种三维培养技术,旨在长期于体外培养具有自我更新和自我组织能力的多细胞团。其最大特点是可以在体外维持来源组织在体内的生理结构和功能。肿瘤组织类器官则是将临床手术切除的肿瘤组织经过分离的肿瘤细胞在体外三维培养起来而形成的微肿瘤模型,可以比较稳定地维持肿瘤细胞在患者体内的特征。应用肝胆肿瘤类器官模型可在一定程度上解决肝癌异质性高的问题,推动药物敏感性等研究,促进精准医学和个性化治疗的发展。本课题借助肝胆肿瘤类器官模型,结合铁死亡诱导剂药物敏感性实验以及高通量测序分析,筛选肝癌中与铁死亡相关的基因,揭示其调控铁死亡表型及分子作用机制并探讨其成为肝癌特异性早期标志物或治疗干预靶点的可行性。研究方法:1、使用临床手术切除的肝癌组织为来源,建立肝胆肿瘤类器官模型并对其进行铁死亡诱导剂药物敏感性实验;2、根据肝胆肿瘤类器官对铁死亡诱导剂的敏感性将其分群,并通过高通量测序技术进行差异表达基因分析,确定待研究的候选基因;3、利用小干扰RNA（Small interfering RNA,SiRNA）在肝癌细胞系中敲降候选基因,并根据敲降后肝癌细胞对铁死亡敏感性的变化进一步聚焦目的基因;4、研究目的基因在肝癌细胞系中的铁死亡表型:应用CAS9-EASY慢病毒系统构建目的基因敲除/敲降细胞系及相应的对照细胞系;应用铁死亡诱导剂/抑制剂的药物研究敲除目的基因对肝癌细胞铁死亡敏感性的影响;共聚焦显微镜研究敲除目的基因对肝癌细胞中二价铁离子水平、ROS水平的影响;试剂盒检测敲除目的基因对肝癌细胞中脂质过氧化水平的影响;裸鼠皮下异种移植瘤实验明确目的基因在体内对肝癌细胞铁死亡敏感性的影响;5、机制探索:应用针对不同靶点的几种铁死亡诱导剂进行药物抑制细胞增殖/生长实验探究目的基因可能的作用靶点;谷胱甘肽含量和谷胱甘肽过氧化物酶活力检测、液相色谱-串联质谱脂质组成分析确定目的基因可能的作用靶点;6、临床印证:免疫组织化学实验与免疫蛋白印迹实验,研究目的基因在临床样本以及裸鼠皮下异种移植肿瘤实验样本中的表达情况,结合临床随访数据进行生存分析,探索目的基因在临床应用中的潜在价值。研究结果:1、以临床手术切除的肝癌组织为来源成功建立了21例肝胆肿瘤类器官模型,按照其对于铁死亡的敏感性分群并通过高通量测序技术进行差异表达基因分析,确定待研究的候选基因;2、体内外实验验证DIS3样3’-5’外切核糖核酸酶2（DIS3 like 3’-5’exoribonuclease2,DIS3L2）是肝癌铁死亡抵抗基因;3、初步明确DIS3L2可能通过调控谷胱甘肽过氧化物酶4通路抵抗细胞发生铁死亡;4、DIS3L2促进肝癌发生发展。结论:本课题通过建立肝胆肿瘤类器官模型模拟患者体内肝脏肿瘤的结构和功能,并对其进行铁死亡诱导剂药物敏感性实验,结合高通量测序结果进行差异表达基因分析筛选得到DIS3L2基因进行下一步研究。通过多种实验证实DIS3L2是肝癌细胞铁死亡抵抗基因。初步探究了肝癌细胞中DIS3L2抵抗铁死亡的作用机制,发现其作用机理不依赖于铁死亡抑制蛋白1（Ferroptosis Suppressor Protein 1,FSP1）或调节脂质过氧化,而是通过调控铁死亡经典分子谷胱甘肽过氧化物酶4（Glutathione Peroxidase 4,GPX4）发挥作用,具体机制有待进一步探索。另外我们还发现与癌旁组织相比,临床肝癌样本中DIS3L2表达水平更高,敲除DIS3L2可抑制肝癌细胞恶性增殖,提示DIS3L2具有促进肝癌进展的作用。上述工作说明靶向抑制肝癌细胞中DIS3L2表达不仅可诱导肿瘤细胞发生铁死亡,同时还可抑制肝癌恶性进展,为将来肝癌患者临床治疗提供了一种新的潜在干预靶点。