论文部分内容阅读
羊毛甾醇14-α去甲基酶(CYP51)是从羊毛甾醇开始合成胆固醇的关键酶，由CYP51催化羊毛甾醇合成的促减数分裂甾醇(MAS)能够模拟促性腺激素的作用，促进小鼠卵母细胞的减数分裂恢复。一系列实验提示MAS可能是促性腺激素作用于卵丘细胞后分泌并将FSH的促减数分裂信号传递给卵母细胞，从而诱导卵母细胞成熟的关键物质。
然而，目前还无法确切证明FSH和MAS之间的关系。我们利用RNA干扰技术敲减FSH诱导的小鼠卵丘细胞中CYP51基因的表达，以确定激素诱导的卵母细胞成熟是否必须有CYP51基因的参与。
实验分三个部分，一是采用尾静脉高压快速注射法，把设计好的四对CYP51干扰分子导入小鼠肝脏，同时以绿色荧光蛋白(GFP)及其干扰分子作为对照。首先筛选出能高效干扰小鼠CYP51基因的siRNA(CYP-1)及其阴性对照(CYP-mismatched)。之后在注射上述干扰分子的小鼠腹腔注射eCG5IU/只，48h后检测卵巢中CYP51的表达；二是卵泡包裹的卵母细胞(FEOs)腔内显微注射干扰分子，体外培养8，12，20，28h后检测CYP51基因表达。之后在注射CYP51-siRNA的FEOs培养液中添加0.02IU/mLFSH或0.5IU/mLLH培养12h，检测卵母细胞成熟状况；三是将脂质体包裹的干扰分子转入体外培养的卵丘包裹的卵母细胞(CEOs)，干扰12h后添加0.02IU/mLFSH，24h后观察卵母细胞成熟情况。
结果：CYP-1干扰48h，能够将肝脏中60％的CYP51mRNA降解，尾静脉高压快速注射法能够筛选出针对CYP51基因的siRNA分子；本方法可能不能充分将CYP51-siRNA分子导入小鼠卵巢；干扰CYP51基因的表达能够显著抑制FSH诱导的小鼠FEOs和CEOs的体外成熟，说明FSH诱导促减数分裂作用需要CYP51基因的激活；LH诱导小鼠卵母细胞恢复减数分裂的能力弱于FSH，并且CYP51-siRNA不能抑制LH诱导的小鼠FEOs体外成熟，提示LH对卵母细胞的促成熟作用中CYP51基因的表达可能不是必须的。
高胆固醇血症是一种与血管内皮机能异常和动脉硬化形成有关的疾病，是引起心脑血管疾病的主要因素。CYP51参与了对从头合成胆固醇的关键酶，3-羟-3-甲基戊二酰-CoA还原酶(HMG-CoAreductase，HMGR)的活性调节，进而参与调节血浆胆固醇的动态平衡。肝脏是体内合成和代谢胆固醇的核心器官，本实验利用RNA干扰技术敲减高胆固醇血症小鼠肝脏中CYP51基因的表达，以缓解或降低其血浆胆固醇水平。将上述CYP51-siRNA分别导入实验性高胆固醇血症小鼠肝脏(3d注射一次，6d/疗程)，以辛伐他汀(治疗高胆固醇血症药物)为阳性对照，6d后检测血脂指标和肝脏中相关基因表达情况。
结果：CYP-1干扰6d，能够将90％左右高胆固醇血症小鼠肝脏CYP51mRNA降解。同时，血浆中低密度脂蛋白(胆固醇的主要存在形式)的含量下降了一半，其降血脂作用和辛伐他汀作用相似；低密度脂蛋白的受体的表达也同时上调了2.5倍，表明细胞吸收血浆中胆固醇的能力增强了。说明siRNA能显著降低高胆固醇血症小鼠肝脏内CYP51基因的表达；CYP51-siRNA不仅能显著降低高血脂小鼠血浆内LDL-c含量，参与血脂的动态平衡调节，而且能显著促进肝细胞表达LDL-R，促进了血浆LDL-c的吸收。初步认为CYP51-siRNA具有降血脂的功效，与他汀类药物相比，它对胆固醇合成的抑制作用更直接。
结论：CYP51蛋白的催化产物MAS可能介导了FSH促减数分裂信号，并将这种信号传递到卵母细胞以启动减数分裂恢复。CYP51的干扰RNA分子能够降低高胆固醇血症小鼠血脂。