【摘 要】
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目的:1、观察乳腺恶性肿瘤癌相关成纤维细胞（Cancer-associated Fibroblasts,CAFs）内成纤维细胞活化蛋白（Fibroblast Activating Protein,FAP）基因沉默在体内外4T1乳腺癌细胞细胞上的生物学效应。2、探索超声靶 向微泡破坏技术（Ultrasound Targeted Microbubble Destruction,UTMD）介导CRISP
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目的:1、观察乳腺恶性肿瘤癌相关成纤维细胞（Cancer-associated Fibroblasts,CAFs）内成纤维细胞活化蛋白（Fibroblast Activating Protein,FAP）基因沉默在体内外4T1乳腺癌细胞细胞上的生物学效应。2、探索超声靶 向微泡破坏技术（Ultrasound Targeted Microbubble Destruction,UTMD）介导CRISPR/Cas9-FAP基因投递系统的可行性。方法:1、从新鲜的4T1鼠乳腺癌组织中分离CAFs并利用免疫荧光技术鉴定。针对CAFs上FAP为靶点设计靶向引导序列（single guide RNA,sgRNA）,制备慢病毒载体溶液（sgRNA/Cas9）及慢病毒载体微泡溶液（MBs-sgRNA/Cas9）。2、CRISPR/Cas9慢病毒转染CAFs,分组处理如下:G1:对照组（CAFs）;G2::CAFs仅由Cas9慢病毒载体转染（CAFs-NC-Cas9）;G3::CAFs分别由sgRNA、Cas9慢病毒载体转染（CAFs-sgRNA-Cas9）。QPCR检测各组基因FAP mRNA水平表达情况。上述三组CAFs细胞分别与4T1细胞株体外共培养后流式细胞学检测4T1乳腺癌细胞的增殖能力。3、构建Bale/c裸鼠移植瘤模型,静脉注射处理,分组如下:G1:对照组生理盐水（NC）;G2:慢病毒载体溶液（sgRNA-Cas9）;G3:慢病毒载体微泡溶液（UTMD-sgRNA-Cas9）,UTMD-sgRNA-Cas9组由超声靶向破坏技术（UTMD）介导。规律记录肿瘤体积,动物活体荧光成像评估慢病毒在小鼠体内的分布,超声弹性成像技术评估各组肿瘤的硬度;实验结束,完整剥离肿瘤,拍照、称重。结果:1、成功鉴定CAFs细胞。2、FAP靶向的 CRISPR/Cas9 系统（CAFs-sgRNA-Cas9）可下调 CAFs 上FAP的表达（P<0.05）,抑制4T1细胞的体外增殖（P<0.05）。3、体内实验显示UTMD-sgRNA-Cas9组、sgRNA-Cas9组小鼠肿瘤生长速度较对照组减慢;UTMD-sgRNA-Cas9组、sgRNA-Cas9组小鼠肿瘤体积及重量均较对照组（NC）减小,差异具有统计学意义（sgRNA-Cas9 vs NC:1232.54±495.42mm3 vs 2035.64±446.68mm3,P=0.0274;0.84±0.30g vs 1.53±0.50g,P=0.0295）（UTMD-sgRNA-Cas9 vs NC:1058.65±767.64mm3 vs 2035.64±446.68mm3,P=0.0393;0.75±0.22g vs 1.53±0.50g,P=0.0129）。此外,可视化微泡和慢病毒载体分布情况显示UTMD-sgRNA-Cas9处理组内基于微泡的载体系统提高投递效率,且降低了肿瘤硬度（P<0.05）,而sgRNA-Cas9组的肿瘤硬度与对照组相比差异无统计学意义（P>0.05）。结论:1、这些数据为4T1乳腺癌甚至其他上皮来源性实体肿瘤微环境FAP靶点基因治疗的可能性提供了理论依据。2、UTMD技术为CRISPR/Cas9系统提供了 一个有效的基因投递方式。
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