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本研究对胶乳中COI1及其启动子区域进行了克隆和分离,并对其表达进行了分析,旨在进一步研究HbCOI1表达调控方式,为茉莉酸信号转导途径的分子机理研究提供重要线索。研究结果如下:
根据已发表的植物COI1的同源保守序列,通过RT-PCR结合RACE的方法获得了与其相应的基因,命名为HbCOI1,该基因的长度为2187bp,编码597个氨基酸,该氨基酸序列与大豆、番茄、拟南芥、、水稻、的COI1同源性分别达到77%、72%、70%和61%。HbCOI1蛋白具有与其它植物COI1类似的2个结构域:F-box和LRRs(leucine-richrepeats)。
利用GenomeWalking的方法获得了巴西橡胶树1014bp的HbCOI1的5’调控序列,分析表明该序列中含有真核生物典型的核心启动子区域(879-928bp),在886bp处存在TATAbox序列。在HbCOI1邻近5’区域,发现一些与真核生物顺式调控元件相似的序列,63bp、85bp和604bp等多处具有CAAT序列;在212bp、385bp和427bp处有5UTRPy-richstretch元件;96bp处存在一个茉莉酸应答相关的元件TGACG;43bp处存在~个与水杨酸应答相关的TCA-element;在145bp处存在一个与抗性和胁迫应答相关的TC丰富重复序列。此外,在626bp、745bp、834bp和864bp处分别有ACGTT-box、GATA-box、ARR1AT和I-box等顺式作用元件。
Southern杂交表明.HbCOI1在橡胶树基因组中是低拷贝基因。
半定量RT-PCR结果显示,茉莉酸和伤害诱导胶乳HbCOI1的表达,乙烯对HbCOI1的表达几乎没有影响,表明HbCOI1参与了伤害响应和茉莉酸应答的反应;HbCOI1的表达具有组织差异性,在胶乳中大量表达,在叶片中次之,在树皮中微量表达。
为了进一步研究HbCOI1的功能,构建了HbCOI1的原核表达载体pGEX.HbCOI1,并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行了表达,IPTG诱导2小时后在SDS-PAGE条带上比对照多出一条特异带,和根据氨基酸序列估算的值相一致。