1鸡传染性法氏囊病(IBD)是由传染性法氏囊病病毒(IBDV)引起的一种急性、高接触性传染病。近年来,由于超强毒株和变异株的出现,传统疫苗的免疫效果已不尽理想,病发后的治疗难度也随之增强,因此,新型抗IBDV制剂的研究已成为当前养禽业的关注热点。本研究将鸡的IFN-α和IL-18基因融合后于毕赤酵母中表达,通过对表达产物的生物学活性检测和抗IBDV中药单体的筛选,研究重组鸡IFN-α-IL-18融合蛋白、中药单体以及二者联合抗IBDV效果和抗病毒机制,为研究抗IBDV新型制剂提供新的思路。1.重组鸡IFN-α-IL-18酵母表达载体的构建与表达为探讨鸡IFN-α和IL-18及其融合蛋白的结构和功能,本研究将鸡IFN-α、IL-18及其融合基因分别置于酵母表达载体p PICZ-αA的AOX1启动子下游,构建重组质粒p PICZ-IFN-α、p PICZ-IL-18和p PICZ-IFN-α-IL-18。将重组质粒分别用Pme I酶切线性化,电转入X-33酵母感受态细胞中,以1%甲醇诱导表达,SDSPAGE和Western blot检测表达蛋白。结果表明,在酵母培养上清液中存在分子量分别为22 KD、23 KD和43 KD的目的蛋白,且该蛋白具有良好的免疫原性。2.重组鸡IFN-α-IL-18融合蛋白的生物学活性研究为探讨鸡IFN-α-IL-18融合蛋白对鸡外周血淋巴细胞转化及核因子κB(NF-κB)的影响。本研究应用淋巴细胞转化试验初步检测重组鸡IFN-α-IL-18融合蛋白的生物学活性,ELISA法测定淋巴细胞中总NF-κB和细胞核中NF-κB的含量。结果表明,表达的IFN-α-IL-18和IL-18蛋白均能明显促进鸡外周血淋巴细胞的转化(P<0.05),IFN-α对淋巴细胞转化有促进作用,但总体差异不显著(P>0.05)。与对照组相比,经IFN-α-IL-18和IL-18作用的鸡淋巴细胞中总NF-κB含量明显增加(P<0.05),细胞核中NF-κB含量差异极显著(P<0.01),IFN-α作用的淋巴细胞中总NF-κB含量与对照组相比差异不显著(P>0.05),细胞核中NF-κB含量显著增加(P<0.05)。IFN-α-IL-18及IL-18能够明显促进淋巴细胞转化,IFN-α促进淋巴细胞转化活性较弱,这种促淋转机制与NF-κB的表达、活化及核质转运有关。3.重组鸡IFN-α-IL-18融合蛋白的抗IBDV效果研究及抗IBDV中药单体的筛选为进一步探讨重组鸡IFN-α-IL-18融合蛋白的抗IBDV活性并筛选出抗IBDV的中药单体,本研究通过鸡胚接种试验对IFN-α-IL-18及连翘苷元、黄芪苷、黄芩素、绿原酸、木犀草酸、马钱酸6种中药单体的抗IBDV效果进行评价。结果表明,IFN-α-IL-18融合蛋白能够显著抑制IBDV在鸡胚中的增殖(P<0.01),IFN-α和IL-18酵母表达产物对IBDV也有明显的抑制作用(P<0.05)。六种中药单体都能一定程度地发挥抗IBDV活性,其中,黄芩素和绿原酸作用极显著(P<0.01)。4.重组鸡IFN-α-IL-18融合蛋白与中药单体的联合抗IBDV效果研究为探索重组鸡IFN-α-IL-18融合蛋白与中药单体的联合抗IBDV效果,本研究将筛选出的具有明显抗IBDV的中药单体黄芩素和绿原酸,分别与不同浓度的重组鸡IFN-α-IL-18蛋白进行组合,接种9日龄鸡胚。IBDV抗原检测结果表明,联合使用黄芩素和重组蛋白IFN-α-IL-18对IBD的预防效果极显著(P<0.01),且优于中药单体组及重组蛋白组。攻毒保护试验中,黄芩素和重组鸡IFN-α-IL-18蛋白组发病率最低,且无病鸡死亡,起到了较好的保护作用。联合使用时,采用10μM黄芩及300μg IFN-α-IL-18的组方能够发挥最佳的抗病毒活性。这为进一步寻找防治IBD的最佳方法做了有益的探索。