【摘 要】
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研究目的:结直肠癌与遗传和环境风险因素有关,是最常见的危及生命的癌症之一。手术、放疗、化疗是结直肠癌常见的治疗方式。其中化疗手段包括使用氟尿嘧啶类药物或铂类药物等,但是化疗成本高,且结直肠癌患者对化疗药物容易产生耐药性,其严重限制了结直肠癌患者的治疗效果。因此,亟待开发出一种新的、有效的、副作用少的结直肠癌治疗药物。目前,结构丰富的天然产物作为分子靶向抗肿瘤药物的重要来源,逐渐成为抗肿瘤研究热点。
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研究目的:结直肠癌与遗传和环境风险因素有关,是最常见的危及生命的癌症之一。手术、放疗、化疗是结直肠癌常见的治疗方式。其中化疗手段包括使用氟尿嘧啶类药物或铂类药物等,但是化疗成本高,且结直肠癌患者对化疗药物容易产生耐药性,其严重限制了结直肠癌患者的治疗效果。因此,亟待开发出一种新的、有效的、副作用少的结直肠癌治疗药物。目前,结构丰富的天然产物作为分子靶向抗肿瘤药物的重要来源,逐渐成为抗肿瘤研究热点。芳樟醇作为一种天然产物,是一种单萜醇,具有抗病毒、消炎和抗菌的特性,存在于罗勒、月桂、茉莉花、红木和薰衣草中。此前的报道显示,它对乳腺癌和肝癌具有抑制作用,但在结直肠癌中作用及机制远未阐明清楚。本课题将在人结直肠癌SW480细胞中探究芳樟醇抗结直肠癌作用及机制,为抗肿瘤新型分子靶向药物设计及开发提供新思路。研究方法:1.不同浓度芳樟醇处理SW480结直肠癌细胞后显微镜下观察细胞形态,使用CCK-8法检测芳樟醇对细胞增殖的影响。2.不同浓度芳樟醇处理SW480细胞后,分别经过核染色,膜染色以及DCFH-DA探针等处理,对细胞凋亡程度通过荧光显微镜（Fluoresence microscope）下观察以及流式细胞仪检测,并用流式细胞术对细胞周期以及胞内ROS水平进行检测。3.采用蛋白免疫印迹法（Western Blot,WB）分别对不同浓度芳樟醇处理后的SW480细胞的周期相关蛋白（p21和Cyclin D1）、凋亡相关蛋白（Cleaved-PARP）、自噬相关蛋白（Beclin-1和LC3B）以及AKT/GSK-3β通路相关蛋白检测。4.分别加入ROS清除剂（NAC）以及自噬抑制剂（3-MA）对SW480细胞预处理后,CCK-8法检测芳樟醇刺激后对细胞活力的影响,并通过WB检测NAC处理后AKT/GSK-3β通路相关蛋白的表达。研究结果:1.CCK-8检测结果显示芳樟醇能够显著抑制SW480细胞的活力,且具有明显的浓度依赖性。形态学观察结果也显示出随着芳樟醇浓度的增加,SW480细胞死亡数量增多。2.通过流式细胞术我们可以得出,芳樟醇不同浓度处理后的SW480细胞周期在G0/G1期占比随浓度的增加而增大,WB结果得出芳樟醇浓度增加能够上调p21蛋白的表达并且下调Cyclin D1蛋白的表达。3.对不同浓度芳樟醇处理的SW480细胞DAPI核染色后观察结果显示,随着芳樟醇浓度的增加,胞内荧光点数逐渐增多且强度增强。通过流式细胞术,我们发现SW480细胞凋亡数量随药物浓度增加而增多,WB检测发现,Cleaved-PARP蛋白表达随芳樟醇浓度增加呈上调趋势。4.我们对不同浓度芳樟醇处理过的SW480细胞内的ROS水平通过流式细胞术进行检测,结果显示,SW480细胞内ROS水平与芳樟醇浓度呈正相关关系。加入ROS清除剂处理后,NAC可减弱芳樟醇对SW480细胞活力的抑制作用。5.对AKT/GSK-3β通路蛋白检测结果表示,芳樟醇浓度的增加能够使p-AKT和p-GSK-3β两种蛋白的表达降低;同时在加入NAC后,相比于单药物组,p-AKT和p-GSK-3β蛋白表达升高。6.对SW480细胞自噬相关蛋白检测显示,芳樟醇能够上调LC3B-Ⅱ以及Beclin-1蛋白的表达。CCK-8法实验结果表明,自噬抑制剂3-MA可降低药物芳樟醇对SW480细胞活力的抑制作用。研究结论:本研究表明,芳樟醇能够诱导SW480细胞阻滞于G0/G1期来抑制细胞增殖,芳樟醇能够诱导细胞凋亡且通过提高SW480细胞内ROS水平抑制AKT/GSK-3β通路实现其抗肿瘤效应,同时能够引起SW480细胞自噬。本课题研究说明,芳樟醇可作为潜在抗肿瘤药物,为结直肠癌的新药开发提供新方向。
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