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山羊痘(Goat pox)是由山羊痘病毒(Coatpox virus,GTPV)感染引起的一种急性、热性、高度接触性的地方流行性传染病,是养羊业中需要重点防控的动物疫病之一。其特征是体温升高(40~42℃),眼、鼻分泌物增多,全身皮肤、呼吸道及消化道黏膜出现圆形或椭圆形丘疹或痘疹。世界动物卫生组织(World Organisation for Animal Health,OIE)把羊痘列为必须申报的动物疾病,我国将此病列为一类动物疫病。为了解我国山羊痘病毒的分子遗传特征以及抗病毒天然免疫情况,为进一步研发新的疫苗及治疗制剂提供理论依据。本论文对2012年10月福州郊区某山羊养殖场爆发疑似山羊痘病例,从病原学、病理学及致病机理等方面进行系统研究。1、剖检患病山羊,肉眼可见全身皮肤、肝脏、肺脏及瘤胃浆膜面有大小不一灰白色的痘疹结节。病理组织学观察可见皮肤角质化,炎性细胞增多,棘细胞胞浆内可见嗜酸性病毒包涵体;间质性肺炎及肺泡上皮细胞增生;肝脏中度脂肪变性及空泡变性;脾淋巴小结变少或消失;肾小囊有渗出物,肾小管上皮细胞变性,可见有溶血现象和蛋白尿。用绵羊胚胎鼻甲(Ovine fetal turbinate,OFTu)细胞进行病毒分离培养,盲传第2代时观察到细胞病变,从第3代开始,48 h可出现稳定的细胞病变,表现为变圆、聚集、折光度增加,坏死、脱落而形成空洞。成功分离到1株山羊痘病毒,命名为GTPVFZ株。2、病毒大量增殖后经蔗糖不连续梯度离心,得到2条白色病毒带,分别在蔗糖梯度24%~28%和36%~40%之间,经电镜观察36%~40%这层病毒粒子纯度较高,病毒形态较完整。扫描电镜观察病毒粒子表面形态,可见圆形、卵圆形或砖形,表面粗糙,中间隆起、周围凹陷象草帽状的病毒粒子,大小约250~350 nm。电镜负染观察到两种类型的病毒粒子,一种是电子密度中央透明病毒粒子,另一种是电子密度致密的病毒粒子,有囊膜。GTPV感染OFTu细胞,制作超薄切片,透射电镜观察病毒粒子呈圆形或卵圆形颗粒,可见两面凹陷呈哑铃形的核酸芯髓和两个侧小体结构。病毒在胞浆中复制、增殖,装配好的病毒以细胞膜出芽和细胞溶解方式释放病毒粒子。感染细胞超微结构表现为细胞浆空泡增多,内质网扩张呈囊状、囊腔内充满絮状物,池内分离,可见细胞凋亡早期改变;线粒体增生、嵴肿胀、变暗、模糊不清;高尔基体出芽;最后感染细胞被病毒破坏、溶解,可见残留的包涵体。3、采用高通量Illumina新一代测序技术,获得GTPVFZ株完整的全基因组序列,全长为150194 bp,G+C含量为25%,编码151基因,长度从42到2008个氨基酸不等。基因组两端反向重复序列(ITRs)长2301 bp,形成环状的发夹结构,两端的ITR序列分别包含2个基因(GTPV001,002,146,151)。(1)GTPVFZ与其它山羊痘基因组相比显示出高变异性(尤其是末端区域),与GTPVPL有765个碱基的不同,而与GTPVGV有774个碱基的不同。氨基酸水平上有3个基因(GTPV007,072和129.5)的同源性小于90%;(2)GTPVFZ与绵羊痘(SPPV)基因组相比,同源性平均为96.9%,在氨基酸水平上,有4个基因同源性100.0%,96个基因同源性96.0%~99.9%,44个基因同源性90.0%~95.9%,5个基因同源性80.0%~89.9%;(3)GTPVFZ与牛疙瘩皮肤病病毒(LSDV)的NI-2490、NW-LW和LW-1959基因组相比,同源性分别为97.4%、97.8%和97.8%;(4)全基因组进化树分析GTPVs、SPPVs和LSDVs,结果分成3个独立的分支,而GTPVs遗传进化关系更接近于LSDVs,与SPPVs亲缘性较远。4、为了理解山羊痘病毒的发病机制,本研究做了山羊痘病毒感染细胞和山羊的实验。结果显示,GTPV感染OFTu和山羊成纤维上皮(GSF)细胞,没有检测到明显的天然免疫应答信号。然而GTPV感染山羊,在外周血淋巴细胞和脾脏、肺脏中检测到宿主抗病毒天然免疫反应信号,信号传导通过识别TLR2和TLR9受体,激活核转录因子IRF3和IRF4,诱导Ⅰ型干扰素(IFN-α、IFN-β)的表达,触发抗病毒基因(IFITM3、ISG15和ISG20)和炎症细胞因子(IL-6、IL-1 β、IL-18和TNF-α)的大量分泌。此外,GTPV感染在脾脏和肺脏中检测到高表达SOCS-1和p-STAT3。研究表明GTPV感染山羊能激发宿主天然免疫反应信号。5、采用GTPVFZ株全病毒抗原免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞按常规方法进行融合,用间接ELISA和免疫荧光抗体方法筛选,并经有限稀释法克隆,获得2株IgM亚型,能稳定分泌抗GTPV单克隆抗体的杂交瘤细胞株,为病毒与机体互作的致病机理研究和临床快速诊断奠定基础。