第一部分青少年起病与成人起病的1型糖尿病男性患者骨微结构临床分析[研究背景]1型糖尿病（T1D）患者骨折风险升高,除骨密度下降外,还存在骨微结构异常。关于T1D患者骨微结构研究的报道较少,至今尚无研究报道亚洲T1D人群高分辨外周定量CT（HR-pQCT）测定的骨微结构相关数据。此外,T1D患者起病年龄是其骨折风险的重要影响因素,起病年龄也可能对其骨微结构产生不同影响。[研究目的]比较成人男性T1D患者与对照组HR-pQCT测定的骨密度和微结构差异,弥补亚洲T1D人群HR-pQCT的研究空白;进一步比较青少年起病与成人起病的T1D患者骨密度和微结构的差异,探索起病年龄对骨密度及骨微结构的影响。[研究方法]本横断面研究纳入32名成人男性T1D患者,以及32名与其性别、年龄、BMI 1:1匹配的健康受试者。T1D患者根据起病年龄在18岁之前或之后分为青少年起病组和成人起病组。收集人口学资料,人体测量学参数和生化指标。使用DXA测定腰椎及髋部面积骨密度（aBMD）,使用HR-pQCT测定桡骨和胫骨远端的体积骨密度（vBMD）与骨微结构。分别进行总体T1D患者与总体对照组,成人起病的T1D患者与其对应的对照组,青少年起病的T1D患者与其对应的对照组,以及成人起病的T1D患者和青少年起病的T1D患者之间的比较。[研究结果]1、一般特征:32例T1D患者中,15例为青少年起病,平均年龄为32岁,平均起病年龄为10岁,中位病程为11年,另外17例为成人起病,平均年龄36岁,平均起病年龄29岁,中位病程7年。T1D患者中有6例患者有骨折史,均与外伤或跌倒相关,平均HbA1c为7.0%,平均25羟维生素D为20.7ng/ml,平均睾酮为5.1ng/ml。与青少年起病组相比,成人起病组T1D患者BMI和腰围更低（p=0.002和p=0.003）,糖尿病病程更短（p<0.001）,每日使用的胰岛素总量更低（p=0.003）。尽管两组患者β-CTX水平没有差异,但成人起病组T1D患者血清ALP水平比青少年组更低（p=0.037）。两组患者在年龄、血糖控制水平、血压、尿ACR、血清钙、磷、25羟维生素D及睾酮水平方面无显著差异（p均>0.05）。2、在桡骨:总体T1D患者的总体积骨密度（Tt.vBMD）,松质骨体积骨密度（Tb.vBMD）,骨小梁体积分数（Tb.BV/TV）,骨小梁厚度（Tb.Th）及皮质骨厚度（Ct.Th）均较总体对照组显著降低（p均<0.05）,而骨小梁分离度（Tb.Sp）较总体对照组显著升高（p=0.024）。成人起病组和青少年起病组T1D患者较其相应的对照组相比,Tt.vBMD（p=0.009;p=0.006）,Tb.vBMD（p=0.007;p<0.001）,Tb.BV/TV（p=0.006;p=0.001）以及Tb.Th（p=0.003;p<0.001）均显著降低。校正BMI,病程和胰岛素剂量后,青少年起病组 T1D 患者 Tb.vBMD（-1.6%,p=0.066）,BV/TV（-4.3%,p=0.05）和Tb.Th（-8.3%,p=0.064）较成人起病组相比有降低趋势,而成人起病组T1D患者皮质骨孔隙率（Ct.Po）较青少年起病组相比有升高趋势（+22.6%,p=0.070）。3、在胫骨:总体 T1D 患者 Tt.vBMD（p=0.006）,Tb.Th（p=0.003）和 Ct.Th（p=0.018）较总体对照组显著降低。成人起病组T1D患者的Tt.vBMD（p=0.027）和皮质骨体积骨密度（Ct.vBMD）（p=0.021）较总体对照组显著降低,而Ct.Po较总体对照组显著升高（p=0.036）,而青少年起病组T1D患者的Tb.Th（p<0.001）和1/Tb.N.SD（p=0.023）较对照组显著降低。校正协变量后,仅发现成年起病组T1D患者的皮质孔隙直径（Ct.Po.Dm）（+4.3%,p=0.061）较青少年起病组相比有升高趋势。4、DXA测定的腰椎和髋部aBMD在青少年和成人起病的T1D患者中没有差异。此外,校正BMI之后,未发现糖化血红蛋白,尿ACR,25羟维生素D,胰岛素剂量,睾酮水平等临床指标与DXA和HR-pQCT测定的相关参数之间存在显著相关性。[研究结论]本文首次报道了亚洲成人男性T1D患者HR-pQCT数据,发现成人男性T1D患者存在骨密度下降,骨微结构异常。成人起病和青少年起病的T1D患者骨微结构损害存在差异,前者皮质孔隙率倾向于更高,而后者骨小梁倾向于更稀疏。第二部分1型糖尿病小鼠骨代谢异常机制探讨及肠促胰素类药物干预研究[研究背景]1型糖尿病（T1D）骨骼损害的机制错综复杂,免疫炎症异常可能在其中发挥重要作用,但相关研究尚少。利拉鲁肽和利格列汀在特定情境中可与胰岛素联合应用于T1D患者降糖治疗,但其对T1D患者或T1D动物模型骨代谢的影响的研究证据十分稀少。[研究目的]1、在T1D小鼠模型中,观察其骨代谢异常的特点,包括骨密度、骨微结构及骨转换的改变,并使用转录组学测序技术（RNA-seq）及生物信息学分析技术探索其骨代谢异常可能的发生机制,重点关注免疫炎症通路。2、在T1D小鼠模型中,加用利拉鲁肽、利格列汀单药或联合胰岛素干预治疗,探索利拉鲁肽和利格列汀干预对T1D小鼠骨密度、骨微结构及骨转换指标的影响,并使用RNA-seq及生物信息学分析技术探索其可能的机制。[研究方法]1、分组与造模:为使动物模型尽可能模拟人T1D发病机制兼顾动物实验的顺利进行,选择雌性NOD小鼠和雌性C57BL/6J小鼠,前者为自发性T1D小鼠模型（实验中因发病率低注射了 STZ加速T1D发病）,后者腹腔注射STZ构建T1D小鼠模型。注射STZ后测尾静脉血糖≥13.9mmol/L定义为T1D造模成功。所有小鼠分别分为血糖正常对照组,T1D模型组,胰岛素治疗组,利拉鲁肽治疗组,胰岛素+利拉鲁肽治疗组,利格列汀治疗组,胰岛素+利格列汀治疗组。2、治疗与监测:利拉鲁肽使用0.6mg/kg/天,皮下注射;利格列汀使用3mg/kg/d,灌胃;胰岛素选择地特胰岛素10U/kg/d起始,根据血糖调整剂量。每周测量随机体重及血糖,喂养8周后处死留取血清及骨组织标本。3、标本检测:血清标本进行C肽、骨转换指标（P1NP和CTX）及炎症指标检测;胫骨进行Micro-CT测定骨密度、骨微结构,具体包括皮质骨体积骨密度（Ct.vBMD）和松质骨体积骨密度（Tb.vBMD）,皮质骨厚度（Ct.Th）,骨小梁体积分数（BV/TV）,骨小梁数目（Tb.N）,骨小梁厚度（Tb.Th）,骨小梁分离度（Tb.Sp）;股骨进行组织病理形态学分析骨小梁参数及骨髓脂肪细胞计数;选择胫骨进行RNA-seq测定及生物信信息学分析,并挑选表达差异显著的基因进行RT-qPCR验证。[研究结果]1、利拉鲁肽和利格列汀对T1D小鼠体重、血糖及C肽的影响（1）C57-T1D小鼠:T1D组小鼠体重较对照组显著下降,各个降糖治疗组较T1D组无明显恢复,其中胰岛素+利拉鲁肽治疗组体重甚至较T1D组更低（p=0.013）。T1D组小鼠血糖较对照组显著升高（p<0.001）,维持在20mmol/l左右,各个降糖治疗组小鼠血糖较T1D组有下降趋势,其中利拉鲁肽组下降最明显,但均未达到统计学差异（p均>0.05）。T1D组小鼠C肽较对照组下降,未达统计学差异（p=0.206）,利拉鲁肽及利格列汀治疗组C肽较T1D组下降,而使用胰岛素各组均有升高的趋势,其中胰岛素+利格列汀治疗组C肽升高达到统计学差异（p=0.008）。总体而言,利拉鲁肽可减轻体重,使血糖降低,利格列汀对体重及血糖无明显影响。（2）NOD-T1D小鼠:T1D组小鼠体重较对照组显著降低（p<0.001）,各降糖治疗组较T1D组体重有所回升,其中胰岛素治疗组较T1D组体重增加达到统计学差异（p=0.027）。T1D组血糖较对照组显著升高（p<0.001）,逐渐升高至维持在30mmol/l左右,各治疗组血糖较T1D组轻度下降,均未控制到正常,其中胰岛素+利拉鲁肽治疗组血糖下降到20mmol/l左右,达到统计学差异（p=0.007）。T1D组小鼠C肽较对照组降低,但未达统计学差异（p=0.314）,除胰岛素治疗组C肽较T1D组升高外,其余各组均降低,均未达到统计学差异（p均>0.05）。总体而言,利拉鲁肽可减轻体重,利拉鲁肽联合胰岛素治疗可轻度降低血糖,利格列汀对体重及血糖无明显影响。2、T1D小鼠骨密度及微结构特点及利拉鲁肽和利格列汀干预作用（1）C57-T1D小鼠:Micro-CT测定的骨密度及微结构参数显示:T1D组小鼠Tb.vBMD及Ct.vBMD较对照组显著降低（p均<0.001）,经过治疗后,Tb.vBMD仅在利拉鲁肽治疗组增加达到统计学差异（p=0.007）,Ct.vBMD在降糖治疗各组均回升达到统计学差异（p均<0.05）。T1D小鼠皮质及松质骨微结构较对照组相比均存在异常,表现为BV/TV、Tb.N、Ct.Th显著下降,Tb.Sp显著升高（p均>0.05）,利拉鲁肽单药或联合胰岛素治疗有改善松质骨微结构的趋势,但均未达到统计学差异（p均>0.05）,各降糖治疗组均可显著增加Ct.Th（p均<0.05）。骨组织病理形态学测定的骨小梁参数及骨髓脂肪细胞数目在各组无显著差异（p均>0.05）。总之,C57-T1D小鼠胫骨骨密度较对照组下降,皮质骨变薄,骨小梁更加疏松,利拉鲁肽单药或联合胰岛素治疗可改善其降低的骨密度及异常的骨微结构,而胰岛素,利格列汀单药或联合胰岛素对松质骨密度及微结构无改善作用,仅能改善其皮质骨密度及皮质厚度。（2）NOD-T1D小鼠:Micro-CT测定的骨密度及微结构参数显示:T1D组小鼠Tb.vBMD较对照组显著降低（p=0.043）,Ct.vBMD的下降未达统计学差异（p均<0.05）,经过治疗后,Tb.vBMD在胰岛素治疗组,利拉鲁肽治疗组,及胰岛素+利拉鲁肽组升高均达到统计学差异（p均<0.05）。松质骨及皮质骨微结构参数在T1D组倾向于存在异常,但均未达统计学差异（p均>0.05）。骨组织病理形态学测定的骨小梁参数在T1D组倾向于异常,但未达统计学差异。总体而言,NOD-T1D小鼠松质骨密度显著下降,松质骨结构倾向于异常,但异常的参数较少,考虑可能是因为T1D持续的时间仅6周,还未能出现显著的形态学改变所致。胰岛素,利拉鲁肽单药或联合胰岛素治疗可改善其降低的松质骨密度,利格列汀或联合胰岛素治疗对骨密度及微结构均无改善作用。3、T1D小鼠血清骨转换指标、炎症指标及利拉鲁肽和利格列汀干预作用（1）C57-T1D小鼠:T1D组小鼠P1NP较对照组略有升高,未达统计学差异（p=0.138）,各治疗组中仅利格列汀组P1NP较T1D组降低达到统计学差异（p=0.016）,胰岛素组较其他各治疗组均显著升高（p均<0.05）。CTX在各组间无统计学差异（p=0.405）。TGFβ在各组间无统计学差异（p=0.353）。（2）NOD-T1D小鼠:T1D组小鼠P1NP较对照组降低,未达统计学差异（p=0.162）,各治疗组与T1D组相比未达统计学差异,胰岛素组较利拉鲁肽和利格列汀组显著升高（p均<0.05）。CTX在各组间无显著差异（p=0.252）。TGFβ在各组间无显著差异（p=0.998）。4、C57-T1D小鼠胫骨组织RNA-seq及生物信息学分析结果由于NOD小鼠T1D持续时间较短,其骨代谢方面的改变不显著,遂仅从C57-T1D小鼠中选择对照组,T1D组,及利拉鲁肽组每组各3个胫骨标本进行RNA-seq测定。生物信息学分析结果显示:T1D组与对照组相比共发现1031个差异基因,936个基因表达上调,95个基因表达下调,利拉鲁肽组与T1D组相比共发现1280个差异基因,其中443个基因表达上调,837个基因表达下调。KEGG通路分析显示这些差异基因主要富集在免疫炎症相关的信号通路,其中与骨代谢相关的通路包括TNFα信号通路,破骨细胞分化信号通路,NFκB信号通路,Th17细胞分化通路,IL-17信号通路,PPARγ信号通路等。5、在C57-T1D小鼠中对RNA-Seq筛选的差异基因进行RT-qPCR验证选择组间表达差异显著,且与成骨、破骨及免疫炎症相关的基因,在C57-T1D小鼠中进行RT-qPCR验证。RT-qPCR结果显示:（1）T1D组小鼠骨组织中成骨相关基因（Runx2 mRNA,OC mRNA）,破骨相关基因（c-fos mRNA,TRAP mRNA）表达均显著增加（p 均<0.05）,RANKL/OPG mRNA 比值显著升高（p=0.033）,说明破骨过程倾向于更加活跃。T1D组小鼠骨组织中PPARγ mRNA、TNFα mRNA 和 IL-17 mRNA 表达均显著增加（p 均<0.05）,TGF-β mRNA 与对照组相比无显著差异（p>0.05）。（2）利拉鲁肽治疗组Runx2 mRNA、OC mRNA和TRAP mRNA较T1D组显著降低（p均<0.05）,胰岛素+利拉鲁肽组OC mRNA和TRAP mRNA较T1D组显著降低（p均<0.05）,利拉鲁肽组及胰岛素+利拉鲁肽组RANKL/OPG mRNA比值与T1D组无显著差异（p均>0.05）。利拉鲁肽组PPARγ mRNA、TNF α mRNA较T1D组显著下降（p均<0.05）,胰岛素+利拉鲁肽治疗组IL-17 mRNA和TNF α mRNA较T1D组降低达到统计学差异（p均<0.05）。（3）利格列汀治疗组OC mRNA较T1D组进一步升高,达到显著性差异（p=0.044）,胰岛素+利格列汀组RANKL/OPG mRNA 比值较T1D组显著降低（p<0.001）。利格列汀治疗组IL-17 mRNA较T1D组显著升高（p=0.007）。这部分结果说明,T1D小鼠成骨及破骨相关基因表达均增加,但RANKL/OPG比值升高,说明破骨过程倾向于更加活跃;同时PPARγ表达增加,炎症因子IL-17和TNF α表达增加。利拉鲁肽单药或联合胰岛素治疗对成骨及破骨相关基因的表达均是抑制的,对RANKL/OPG比值的影响不大,且可抑制PPARγ及炎症因子的表达。利格列汀联合胰岛素组RANKL/OPG显著降低,破骨活性被抑制。[研究结论]1、T1D小鼠存在骨密度下降及骨微结构异常,同时存在破骨过度激活,以及IL-17 和 TNF α 的表达升高,提示 IL-17/TNFα 可能通过激活破骨活性参与 T1D 骨代谢异常的发生发展,为后续深入的直接机制研究奠定了基础。2、利拉鲁肽单药或联合胰岛素治疗可以使T1D小鼠下降的骨密度及异常的骨微结构得到改善,而利格列汀无此作用,利拉鲁肽的骨保护作用可能与其抑制炎症因子进而抑制破骨细胞活性相关,为临床降糖药物的选择提供了新的实验依据。