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近年来,我国茶园经常遭受低温、干旱等自然灾害,严重影响茶叶产量和品质,因此研究茶树如何响应低温和干旱胁迫很有必要。苯丙烷类合成途径是植物体内一个十分重要的次级代谢途径,多种代谢产物如花青素、木质素、水杨酸、类黄酮和植物抗毒素的合成都是源于苯丙烷类合成途径,它们在植物抗逆过程中发挥着重要的作用。苯丙氨酸解氨酶是该途径的限速酶,确定其编码基因对了解茶树在低温、干旱下的胁迫响应具有重要的意义。本研究基于茶树基因组研究结果,克隆获得了南川大树茶苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanineammonialyase,PAL)家族基因成员CsPAL-a和CsPAL-d的cDNA和启动子序列,推导了其编码的氨基酸序列,并对其进行了生物信息学分析。对南川大树茶两年生植株进行4℃低温和PEG6000模拟干旱处理,通过测定遭受胁迫后的茶树叶片内可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、脯氨酸含量、丙二醛含量、相对电导率和抗氧化酶活性,分析了以上两种胁迫对南川大树茶和CsPAL-a、CsPAL-d的表达模式的影响。利用实时荧光定量和组织化学染色法分析了CsPAL-a和CsPAL-d的组织特异性表达。借助在模式植物拟南芥中过表达验证了CsPAL-a和CsPAL-d的功能。主要结果如下:1、茶树CsPAL-a和CsPAL-d基因的克隆和序列分析从南川大树茶中克隆获得两个PAL基因,分别为CsPAL-a和CsPAL-d。其中CsPAL-a的ORF框长2121 bp,编码706个氨基酸残基,推测分子量77.08 kD,等电点6.26。CsPAL-d的ORF框长2145 bp,编码714个氨基酸残基,推测分子量77.73 kD,等电点6.12。序列分析显示CsPAL-a和CsPAL-d均为亲水性蛋白,不含有跨膜结构域,均具有苯丙氨酸解氨酶的保守结构域,在系统进化关系上与葡萄的亲缘关系较近。2、CsPAL-a和CsPAL-d响应低温和干旱胁迫qPCR检测结果表明,在正常生长条件下,南川大树茶叶片中CsPAL-a的表达量约为CsPAL-d的7倍,当人为对南川大树茶进行低温和干旱处理后,发现CsPAL-a和CsPAL-d的表达水平均显著提高,CsPAL-a表达上调约3倍,CsPAL-d表达上调高达10倍。这表明CsPAL-a和CsPAL-d在南川大树茶抵抗低温和干旱胁迫方面发挥着积极作用。3、CsPAL-a和CsPAL-d基因在南川大树茶中的表达模式qPCR检测结果表明,CsPAL-a在茶树各个组织部位均有表达,茎中相对表达量最高,其次分别是嫩芽和第一叶,成熟叶中最低;CsPAL-d在成熟叶(第四叶)表达量最高,其次是嫩芽和第一叶。表明CsPAL-a和CsPAL-d在南川大树茶中具有不同的表达模式。4、CsPAL-a和CsPAL-d基因的表达水平抗寒抗旱能力对过表达拟南芥材料进行(Abscisic acid,ABA)、JA茉莉酸(Jasmonic acid,JA)敏感性分析。结果表明,相对于野生型,转基因拟南芥种子的萌发率降低;对两种转基因拟南芥材料进行不同程度(4℃和-20℃)低温处理和人工模拟干旱处理,结果显示转基因拟南芥具有更强的耐寒、耐旱能力。5、CsPAL-a和CsPAL-d启动子的克隆和功能分析对启动子功能的研究可以明确基因的表达特征和调控机制,有助于对基因功能的分析。因此本研究分别克隆CsPAL-a上游1232 bp和CsPAL-d上游1643 bp的调控序列,这些调控序列中均含有核心转录元件TATA-box,CAAT-box等常见顺式作用元件及大量植物典型的光反应元件。此外,这些序列中还含有许多特异响应元件,如低温响应元件、干旱响应元件、乙烯响应元件、生长素响应元件、胁迫响应元件等。将克隆到的启动子融合GUS基因,进行拟南芥遗传转化并进行GUS染色分析,结果显示:CsPAL-a和CsPAL-d的启动子拟南芥在成熟叶片、幼苗、根中均能检测得到GUS信号,在角果中未检测到GUS信号,表明所克隆的启动子具有组织表达特异性。