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目的:1.探讨小剂量顺铂对人肺腺癌细胞中erccl基因表达的影响及其与肺癌耐药的关系。2.探讨RNA干扰技术封闭ERCC1基因表达对顺铂耐药的影响,进一步证实ERCC1在肺癌顺铂耐药中的作用及寻求逆转耐药的方法。
方法:1.常规培养A549和A549/CDDP细胞,以顺铂处理A549细胞,分别采用RT-PCR法和免疫细胞化学法检测细胞中ERCC1Mrna及蛋白表达。2.以四氮唑蓝比色法(MTT)检测A549/CDDP的耐药指数(RI)。3.以脂质体包裹pgenesil-1为载体的sirna-erccl体外转染A549/CDDP细胞,荧光显微镜下观察并测定转染效率。4.采用RT-PCR法和免疫细胞化学(SABC)法分别检测转染细胞Ercclmrna及其蛋白表达。5.MTT法测定转染后细胞存活率和生长抑制率,计算半效抑制浓度(IC<,50>)及转染后的耐药倍数。
结果:1.A549/CDDP细胞耐药指数为9.06。2.在时间组,10μmol/L顺铂处理A549细胞,12hrs组erccl mrna和蛋白水平开始增高,分别达(49.63±6.97)[％]和(50.94±8.64)[％],72hrs组达高峰,分别为(66.69±5.30)[％]和(72.06±6.45)[％],与对照组比较,差异均有显著性(P<0.05)。在浓度组,5μmol/L顺铂处理时,erccl mrna和蛋白水平开始增高达(41.03±5.71)[％]和(51.73±10.56)[％],20μmol/L顺铂处理时达高峰,分别为(79.50±5.46)[％]和(68.08±5.55)[％]。40μmol/L顺铂处理时,上调效应减弱,但和对照组比较,差异均有显著性(P<0.05)。3.A549/CDDP耐药细胞中erccl mrna和蛋白表达增高,达(94.11±6.81)[％]和(88.43±4.13)[％],与A549敏感细胞比较,差异均有显著性(P<0.05)。4.针对erccl的sirna转染A549/CDDP后，A549/CDDP细胞ERCCl mRNA及蛋白表达下调，SiRNA-ERCCl(300nM)组效应最强，分别下降至(11.19±6.82)％和(20.88±6.57)％，与各对照组比较，均有显著性变化(P0.05)。5．转染组A549/CDDP细胞耐药倍数减为6.05、4.64、2.94，空载体组和SiRNA-neg组细胞的IC<,50>及耐药倍数则均无明显改变(P>0.05)。结论：(1)小剂量顺铂可以上调人肺腺癌细胞ERCCl的表达，并可能参与了肺腺癌顺铂耐药的形成。(2)RNAi技术可有效、特异的封闭ERCCl基因的表达，较大程度逆转耐顺铂人肺腺癌细胞对顺铂的耐药性。(3)ERCCl可以做为逆转肺癌顺铂耐药的有效靶点。