论文部分内容阅读
卵巢癌是女性生殖器常见肿瘤之一，严重威胁妇女健康和生命。传统治疗以手术为主，辅以化疗，虽然能改善晚期卵巢癌患者的近期治疗效果，但并未明显提高患者的5年生存率，其治疗依然是临床棘手的问题，因此寻求新的治疗方法具有重要的意义。 随着肿瘤生物学和免疫学等基础学科的发展，以及对肿瘤发生、发展的进一步认识，为卵巢癌进行生物学治疗开辟了一个广阔的领域，其中过继性免疫治疗(adoptive immunotherapy，AIT)备受重视，包括淋巴因子活化的杀伤细胞(lymphokine-activated killer cells，LAK细胞)和肿瘤浸润淋巴细胞(tumorinfiltrating lymphocytes，TIL)，在一些肿瘤动物模型和某些肿瘤患者的临床试验中显示有一定效果。但是，由于LAK和TIL细胞均以T细胞为主，T细胞发挥作用必须经过复杂的免疫激活过程，而患者肿瘤细胞多处于免疫逃逸状态，所以疗效欠佳，且治疗过程中需辅以大剂量IL-2，副作用较多，限制了临床上的应用。 自然杀伤细胞(natural killer cell，NK细胞)是先天免疫中的一类十分重要的淋巴细胞，由于无需抗原存在或预先致敏，就可直接杀伤肿瘤和病毒感染的靶细胞，还可分泌IFN-γ和TNF-α等细胞因子，因此在机体抗感染、抗肿瘤、免疫调节和造血调控等方面发挥重要的功能。显然，NK细胞可以作为肿瘤AIT的一种选择。但是，由于从肿瘤患者分离的NK细胞存在一些功能缺陷，以及NK细胞难以在体外大量扩增并达到临床所需治疗量，因而不能广泛应用于临床。鉴于上述原因，研究者试图通过建立NK细胞系来克服传统方法的不足，目前的研究结果表明，NK-92细胞系极具潜力且适合用来进行肿瘤AIT。 NK-92细胞是1992年从非霍奇金淋巴瘤患者的外周血淋巴细胞中分离出来并建系成功的一种NK细胞系，具有与人NK细胞相似的表面分子特征和功能特点，安徽医科大学硕士学位论文可在体外长期培养、大量扩增，并对多种肿瘤细胞具有杀伤活性。毋庸置疑，NK一92细胞用于肿瘤AIT是有前景的。但是，目前国外研究资料多集中于对血液病肿瘤、恶性黑色素瘤等的治疗研究，对于卵巢癌的研究未见报道。因而本课题研究NK一92细胞对卵巢癌细胞系HO一8910体外杀伤活性及其对卵巢癌动物模型的治疗效果，为卵巢癌的治疗寻求一种新的治疗方法。 由于NK一92细胞具有永生性，可在体外长期培养，直接输注患者体内有增殖成瘤的潜在危险，因此，对NK一92细胞进行放射线照射，既消除了NK一92细胞增殖成瘤的潜在危险，又在一定时间内保留了杀瘤活性，藉此时期的NK一92细胞治疗肿瘤是避害趋利的方法。目的1.探讨不同剂量放射线照射后NK一92细胞治疗人卵巢癌的安全性。2.探讨合适剂量放射线照射后NK一92细胞治疗人卵巢癌的有效性。方法1.体外实验部分1.1细胞计数法检测照射后NK一92细胞的增殖情况 o、100、200、400、500、1600 cGy放射线照射后NK一92细胞培养于六孔板，每组3复孔，每孔细胞浓度5 x 104/ml，每日细胞计数，连续监测5天。1.2 3H一TdR掺入法检测照射后48hrNK一92细胞的增殖活性 0、100、200、400、800、1600 eGy放射线照射后，调整NK一92细胞浓度，于96孔平底板上每孔加入细胞4xl少/200闪，37℃5%c02孵箱中培养，结束培养前更换培养基为即Ml一2640继续培养Zh;每孔加入3H一TdR 0.5林ei，37℃5%CO:温箱培养4h，用多头细胞收集仪将细胞收集于玻璃纤维滤纸上，抽气过滤并用蒸馏水充分洗涤;将滤纸烤干后放入闪烁杯中，加入闪烁液，p一液闪仪检测叩m值。1.3台盼蓝拒染法检测照射后24、48、72hrNK一92细胞的活力安徽医科大学硕士学位论文 取0.2%台盼蓝盐溶液与待计数的细胞悬液1:1混合(细胞在染料中停留时间为3一lomin)，取10川含台盼蓝的细胞悬液滴加到细胞计数板的计数室中，至少计数总数500个细胞，分别计数未染色的活细胞数和染为蓝色的死细胞数。按下面的公式计算活细胞密度和细胞活力。 细胞数/ml=4大格活细胞总数/4 x IO4x稀释倍数 细胞活力(%)=活细胞数/(活细胞数十死细胞数)X 100%1.4 FACS检测照射后NK一92细胞凋亡变化 收集照射后(0、200、400、800 cGy)NK一92细胞，用冷pBS洗2次，IXBinding Bu旋r重悬细胞，调整浓度为2 x 2 06/ml;取1 00抖l(l又10，细胞)，加入5协1 Annexin V-FITC，轻轻混匀，常温避光放置15min;1 XBinding Buffer洗涤细胞2次，加入10拼1 pl，轻轻混匀，常温避光放置10min;IXBinding Buffer 400林l重悬细胞，上机检测。1.55‘c:释放法检测NK一92细胞对Ho一8910和K562细胞的体外杀伤活性 应用标准的4hrs‘c:释放法，检测未照射及照射后NK一92细胞对Ho一8910和K562细胞的体外杀伤活性，每次试验要求自然释放组cPm值<25%最大释放组cPm值，按下列公式计算杀伤活性: 实验组cPm值一自然释放组cPm值 细胞杀伤活性(%)=—x10o% 最大释放组cPm值一自然释放组叩m值1.6 FACS检测照射前后NK一92细胞主要表面标志CD56表达情况 收集照射后(0、800 eoy)NK一92细胞，用pBS洗2次，100林1 pBS重悬细胞;加入适量