1.利用噬菌体表面展示技术构建人肝癌细胞的cDNA表达文库  2.从人肝癌细胞cDNA表达文库中筛选hALR相互作用蛋白

来源 :重庆医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:laobo999
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目的:挑选出对人肝再生增强因子(hALR)高反应性的肝癌细胞株,并以此作为细胞来源,利用噬菌体展示技术构建出人肝癌细胞cDNA表达文库,为进一步从文库中筛选hALR相互作用蛋白奠定基础。 方法:以~3H-TdR掺入法比较hALR对不同肝癌细胞株促增殖作用的大小,从数株中鉴定出一株对hALR刺激具有高反应性的细胞株,以Promega公司PolyATtract System 1000试剂盒通过磁珠分离一步法提取肝癌细胞株的mRNA,然后利用Novagen公司的T7Select10-3 OrientExpress cDNA Cloning System,Random Primer试剂盒构建出肝癌细胞cDNA的噬菌体表面展示文库,通过噬菌体滴度分析和PCR评价cDNA文库质量。 结果:hALR对不同肝癌细胞株均有不同程度的促增殖作用,且呈明显的剂量依赖关系,尤以对QGY促增殖作用最为突出;以QGY细胞作为构建文库的细胞来源,构建出它的cDNA噬菌体展示文库;对构建的肝癌细胞cDNA表达文库进行噬菌体滴度分析,结果表明构重庆医科大学硕士研究生学位论文建出的原始cDNA文J乍中包含的独立的重组子克隆数高达2x107,具有较高的库容量;随机挑取原始cDNA文库中的重组子单克隆进行PCR鉴定,结果表明插入cDNA片断长度在0.2一Zkb之间,平均为0.6kb,能够较好地代表来源细胞中mRNA所表达的几乎所有信息。 结论:QGY细胞较7701和HePGZ细胞对hALR刺激有更高的反应性;以QGY细胞为基础,构建出库容量为2x107的高质量肝癌细胞cDNA的噬菌体表面展示文库。
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