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番鸭呼肠孤病毒(Muscovy duck reovirus,MDRV)是呼肠孤病毒科正呼肠孤病毒属的成员,病毒基因组dsRNA分成三组,即3个大基因片段(L1-L3)、3个中基因片段(M1-M3)和4个小基因片段(S1-S4),在临床上易出现基因重配,衍生出新的病毒株,增加了番鸭呼肠孤病毒致病机理的研究难度。细胞自噬(autophagy)是真核生物中进化保守的对细胞内物质进行周转的生命过程。越来越多的研究表明,细胞自噬与一些病毒复制有着很复杂的联系,有部分病毒甚至可以利用细胞自噬促进病毒复制过程。本课题通过电镜观察自噬体形态学结构、western blotting检测实验组和对照组LC3Ⅱ和p-mTOR的表达、实时荧光定量PCR方法检测p10基因拷贝量,研究MDRV-YB复制与感染细胞自噬的相互影响,进一步探讨该病毒复制的分子机制。其主要实验内容和结果如下:1、电子显微镜观察自噬。收集空白DF-1细胞和MDRV-YB感染的DF-1细胞培养24h后细胞样品,透射电子显微镜下观察自噬体的形态学结构。结果显示,空白细胞结构正常,细胞器均匀分布于细胞内,而MDRV-YB感染细胞中可见典型的包裹胞浆成分的双层膜结构,从形态学角度证实MDRV-YB可以诱导DF-1细胞产生自噬。2、MDRV-YB对DF-1细胞自噬的影响。8组DF-1细胞:空白组、RAPA组、CQ组、YB组、YB灭活组、3-MA+YB组、CQ+YB组和RAPA+YB组,经不同处理后,western blotting检测各组细胞的LC3Ⅱ和p-mTOR的值。结果显示:空白组p-mTOR和mTOR的值基本保持不变,YB组mTOR的值也基本不变,但p-mTOR先减少再升高,且在24 h达到最低;空白组没有检测到LC3Ⅱ,YB感染组中LC3Ⅱ的量先增加后减少,且在36小时达到最大,这两个结果都表明MDRV-YB可诱导DF-1细胞自噬;RAPA组和RAPA+YB组中LC3Ⅱ的量先显著增加再减少,且RAPA+YB组中LC3Ⅱ最大值时间均比RAPA和YB组提前,表明RAPA可以促进MDRV-YB诱导的DF-1细胞自噬;CQ和CQ+YB组LC3Ⅱ的量发生了累积,表明CQ可以阻断MDRV-YB诱导的DF-1细胞自噬;3-MA+YB组中没有检测到LC3Ⅱ,表明3-MA可以阻断MDRV-YB诱导的DF-1细胞自噬;YB灭活组与空白组一样,无LC3Ⅱ,表明MDRV-YB诱导的DF-1细胞自噬依赖于病毒本身的侵蚀能力或需病毒复制的刺激。3、MDRV-YB对番鸭成纤维细胞(MDEF)自噬的影响。6组MDEF细胞:空白组、YB组、RAPA组、CQ组、CQ+YB组和RAPA+YB组。结果显示,空白组p-mTOR和mTOR的值基本保持不变,YB组mTOR的值也基本不变,但p-mTOR先减少再升高,且在36 h达到最低;空白组没有检测到LC3Ⅱ,MDRV-YB感染组中LC3Ⅱ量先增加后减少,且在36小时达到最大,这两个结果都表明MDRV-YB可诱导MDEF细胞自噬;RAPA组、RAPA+YB组和CQ组、CQ+YB组中LC3Ⅱ的变化趋势同DF-1细胞,表明RAPA可以促进MDRV-YB诱导的MDEF细胞自噬,CQ可以阻断MDRV-YB诱导的MDEF细胞自噬。4、DF-1细胞自噬与MDRV-YB非结构蛋白p10和σN表达的相互影响。5组DF-1细胞:空白组、YB组、空质粒组、p10转染组和σNS转染组,经不同处理后,western blotting检测各组细胞的LC3Ⅱ值和p10和σN表达量。结果显示:空白组和空载体组均没检测到LC3Ⅱ条带,YB组、p10组和σNS组中LC3Ⅱ的值均先升高后降低,表明p10和σNS均可诱导转染细胞DF-1自噬;YB和p10组中p10的表达均呈先增加后减少的趋势,与LC3Ⅱ的变化趋势一致,表明非结构蛋白p10的表达依赖于自噬;YB和σNS组中σNS的表达也均呈先增加后减少的趋势,且都在36h达到最大值,与LC3Ⅱ的变化趋势基本一致,表明非结构蛋白σNS的表达也依赖于自噬。5、DF-1细胞自噬对MDRV-YB p10基因的相对拷贝量的影响。3组DF-1细胞:YB组、CQ+YB组和RAPA+YB组,分别培养12h、24h、36h、48h和60h,以YB组为相对参照组、p10为目的检测基因、GAPDH为内参基因进行相对定量PCR。结果显示:这5个时间点,RAPA+YB组中p10的相对拷贝量均最高,CQ+YB组中最低,表明RAPA可以促进p10的复制,CQ会抑制p10的复制。6、自噬对p10复制的影响,将DF-1细胞分为YB组、CQ+YB组和RAPA+YB组 3 组,但分别培养 6、12、18、24、30、36、42、48、54、60h,以克隆的 p10重组质粒为标准品、p10为目的检测基因进行绝对定量PCR。结果显示:3组样品中p10拷贝量均呈先上升后降低的变化趋势,但RAPA+YB组每个时间点p10拷贝量明显高于YB组,YB组明显高于CQ+YB组,进一步表明RAPA可以促进p10的复制,CQ会抑制p10的复制。以上结果表明MDRV-YB可以诱导MDEF和DF-1细胞自噬,但灭活的MDRV-YB不能诱导DF-1细胞自噬,且细胞自噬有利于MDRV-YB在DF-1细胞中的复制。