猪EFNB2基因和POSTN基因的cDNA克隆及SNP筛选

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本研究通过RACE技术从猪的背最长肌中分离出了EFNB2基因,其cDNA序列全长1 991 bp,其中ORF长为1 002 bp,5’端88 bp和3’端901 bp,编码333个氨基酸,其序列已提交至NCBI数据库的Genbank,登录号:KF500033。从Genbank数据库中下载了13个物种的EFNB2基因的序列与其进行同源性分析,结果表明,猪EFNB2基因与同属家畜类的家绵羊进化水平最近,与鱼类和两栖类最远,符合物种进化的一般规律,可能在生长和发育的生物过程中起重要作用。运用荧光定量PCR技术对猪EFNB2基因的组织表达谱的分析表明,EFNB2基因在猪的小肠、盲肠、心脏、肝脏、肾脏、肺脏、脾脏、胰脏、腿肌和背最长肌10个组织中均有表达,表明EFNB2基因表达范围很广泛,在背最长肌中的表达量极显著高于其它组织(P<0.01),说明EFNB2基因在生长初期的背最长肌中参与某些代谢机制和调控。EFNB2基因在两个品种的盲肠中的表达量存在显著差异,这表明其可能与中外猪种的生长速率不一致有关。同时,本文还对猪POSTN基因做了cDNA克隆,结果显示POSTN基因cDNA全长2952bp,它含有2346bp的ORF,5′端长118bp,3′端长488bp,编码781个氨基酸,其序列已提交至Genbank,登录号:KF500034。同源性分析的结果显示,猪POSTN基因与羊和牛同源性最高,而且与哺乳动物形成一个大的分支,与水生生物青鳉鱼的同源性最低,这一结论符合物种进化的一般规律。另外,本研究还对POSTN基因做了SNP分型,PCR-RFLP分型发现在第9内含子上12 835bp处存在C→T的碱基突变。经限制性内切酶HaeШ酶切实验后,产物经2%的琼脂糖凝胶电泳,出现了3种基因型,分别是CC型、CT型和TT型。在宁乡猪、大围子猪、沙子岭猪、这3个地方品种中,C基因为优势等位基因,沙子岭猪C基因频率最高(0.9921),在本地猪种中,均未检测到TT基因型,除了在宁乡猪中杂合子CT基因型占优势外,其余都是CC基因型占优势;在3个外来品种杜洛克猪、长白猪、大白猪中,C基因也为优势等位基因,杜洛克猪C基因频率最高(0.7368),在长白猪中也未检测到TT基因型,且杂合子CT基因型也是优势基因型,其余是CC基因型占优势。运用qRT-PCR技术,以管家基因GAPDH作为内参基因校正POSTN基因的起始表达量,对猪POSTN基因在不同品种的不同组织中表达水平进行相对定量,发现POSTN基因在沙子岭猪和大白猪的10个组织中广泛表达,但在肾和肺中表达量极少,POSTN基因在背最长肌中表达量最高,并且相对于肾和肺的表达量差异极显著(P<0.01);从在两个品种间的表达水平来看,POSTN基因在大白猪的心脏和脾的表达量显著高于沙子岭猪(P<0.05),在小肠中的表达量显著低于沙子岭猪(P<0.05)。
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