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杆状病毒（Baculoviruses）是一类在自然界中专一性感染节肢动物的共价闭合双链环状DNA病原微生物,其基因组大小介于80～180kb之间。根据包涵体的形态特征可将杆状病毒分为两类:多角体病毒（Nucleopolyhedrovirus,NPV）和颗粒体病毒（Granulovirus,GV）。感染鳞翅目昆虫的NPV在其生活周期产生两种不同类型的病毒粒子:出芽型病毒（Budded virus,BV）和包涵体型病毒（Occlusion-derived virus,ODV）。BV是杆状病毒在昆虫体内传播或在培养细胞中传播所必需的,而ODV在杆状病毒经口感染宿主过程中发挥重要作用。苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（Ac MNPV）是杆状病毒的模式物种,80%以上的ORF得到了较好的诠释,本文针对ac82和Cha B两个功能尚不清楚的基因展开研究。其中ac82位于Ac MNPV基因组67376-67918nt之间,长度为543bp,编码了180个氨基酸,预测编码蛋白质分子量为19.7KD。Ac82称为Telokin-like蛋白,通过蛋白序列比对在51种病毒中发现其同源蛋白,这表明Telokin-like蛋白可能在病毒生命周期中起重要作用。2002年Iwanaga在Bm NPV中敲除了Bm68后,病毒似乎正常,只是病毒的DNA复制和BV的产生有所延迟,因此作者推测该基因可能是一个非必需基因。该实验通过Western blot分析显示,Bm68是BV的结构蛋白质。通过BLAST比对发现ac82与Bm68同源性达到85%,2012年Gauthier发现Ac MNPV的温度敏感型突变体感染细胞中的BV的产量大量减少且是由于ac82突变引起的,但释放的BV的感染能力并不受影响。因此推测ac82是产生BV的必需基因。本文将进一步探讨ac82在病毒生活周期中的功能。Cha B是假定的大肠杆菌（E.coli）Cha A的调节子,其存在于细菌、古细菌和杆状病毒中的同源物构成了一个多基因家族。目前,Cha B同源基因在杆状病毒中的功能尚不明确。本文选取了Ac MNPV基因组中的两个Cha B同源基因:ac58/59和ac60为研究对象,探讨Cha B基因在杆状病毒生活周期中的功能。取得的主要研究结果如下:1.ac82的功能研究结果本课题组利用Bac-to-Bac系统和Red同源重组系统构建了ac82缺失、回复的重组病毒和野生型重组病毒。分别将三种重组病毒的DNA转染sf9细胞,通过荧光显微镜观察发现,转染后96h野生型病毒和ac82回复型病毒DNA转染的细胞中,荧光出现的细胞明显增多。然而,在ac82缺失型重组病毒DNA转染的细胞中出现绿色荧光蛋白的细胞数目从转染后48h到120h基本没有变化。收集三种重组病毒DNA转染sf9细胞后120h上清,取相同体积的上清液进行感染实验。发现,缺失型重组病毒v Ac82KO-PH-GFP转染sf9细胞后产生的BV仍具有感染能力,但BV的产量很低;回复型重组病毒v Ac82Rep-PH-GFP和野生型重组病毒v AcPH-GFP产生的BV感染能力基本一致且用光学显微镜观察到,感染72h后野生型病毒和ac82回复型病毒感染的细胞中有多角体出现。三种重组病毒转染sf9细胞的BV生长曲线测定和病毒基因组实时荧光定量PCR实验表明,ac82的缺失影响了感染性病毒粒子BV的产生。通过对三种重组病毒转染的sf9细胞的超薄切片电子显微镜观察,发现野生型重组病毒和ac82回复型重组病毒DNA转染的sf9细胞中都形成了正常的核衣壳,而ac82缺失型重组病毒DNA转染的细胞中没有观察到核衣壳。以上实验结果表明,ac82是杆状病毒生活周期中的一个必须基因,它的缺失可能影响了BV病毒粒子的形成或者病毒出胞。2.Cha B的功能研究结果本文采用Red重组系统在大肠杆菌DH10Bac-p BAD细胞中成功实现了从Ac MNPV Bacmid基因组中敲除靶基因ac58/59、ac60,同时在靶基因位点插入氯霉素基因Cm,构建了缺失型重组病毒v Ac58/59KO、v Ac60KO和v Ac58/59-60KO。为了更直接观察Cha B基因对病毒侵染宿主细胞产生的影响,通过Bac-to-Bac系统将gfp基因和polh基因转座插入到v Ac58/59KO、v Ac60KO和v Ac58/59-60KO上,成功构建了缺失型重组病毒v Ac58/59KO-PH-GFP、v Ac60KO-PH-GFP、v Ac58/59-60KO-PH-GFP和回复型重组病毒v Ac58/59Rep-PH-GFP、v Ac60Rep-PH-GFP、v Ac58/59-60Rep-PH-GFP。并用这6种重组型病毒的DNA转染sf9细胞,在不同的时间点观察荧光产生情况。通过转染实验发现,转染后24h都观察到了绿色荧光且产生绿色荧光的细胞数目相当,说明成功构建了6种重组病毒且转染的初始效率基本相同。转染96h后,在v Ac58/59Rep-PH-GFP、v Ac60KO-PH-GFP、v Ac60Rep-PH-GFP、v Ac58/59-60KO-PH-GFP、v Ac58/59-60Rep-PH-GFP及v AcPH-GFPDNA转染的细胞中,都观察到大量荧光出现,表明ac60的缺失不影响感染性病毒粒子BV的产生。转染120h后,在这6种重组型病毒及野生型病毒v AcPH-GFPDNA转染的细胞中,都观察到成团荧光的出现。表明ac58/59缺失和ac58/59-60缺失并不影响感染性病毒粒子BV的产生,只是推迟了BV的产生。由上述实验结果证明了Ac MNPV基因组中Cha B基因是并不是病毒复制的必需基因,只是推迟了子代病毒粒子BV的产生。