重组鱼腥藻脂肪氧合酶基因的克隆表达、分离纯化及活性分析

来源 :第八届中国酶工程学术研讨会 | 被引量 : 0次 | 上传用户:baoyuan000
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  克隆鱼腥藻PCC7120基因组中脂肪氧合酶(ana-LOX)基因,对该功能基因进行了定点突变研究,确定了ana-LOX的最短功能基因长度,构建原核重组表达载体,对重组ana-LOX进行了分离纯化和性质研究。从GenBank中搜索到鱼腥藻PCC7120基因组中含有LOX基因,通过序列分析和比对,发现LOX功能基因位于双功能酶AOS(单加氧酶)-LOX的C端,通过定点突变研究,证实了ana—LOX活性中心位点为Hisl97、His202、His369、Asn373和Ile455。通过逐步缩短基因长度的策略,获得ana-LOX基因的最短功能基因长度为1254 bp。构建的表达载体pET-32a/ana-LOX转化入BL21(DE3)宿主内,在低温16℃条件下的诱导表达,重组脂肪氧合酶活力可达6750 u/mL。表达产物通过Ni-NTA亲和柱进行分离纯化,比活达到11.4x104 u/mg蛋白,酶活回收率为60.89%。重组ana-LOX最适反应温度45℃,最适反应pH6.O,在常温下具有较好的稳定性,金属离子Fe2+,M92+、ca2+对该酶存在明显的激活作用,而Fe3+和cu2+对该酶有强烈的抑制作用.重组ana-LOX能够改善面团的显微结构.该研究获得了高效表达重组ana—Lox,为实现其在食品加工中的应用提供了参考。
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