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脂肪氧合酶(LOX)能催化具有顺，顺-1，4-戊二烯结构的多元不饱和脂肪酸的双加氧反应。反应过程当中产生具有共轭双键的氢过氧化物，这些氢过氧化物是重要的生化反应中间体，在食品、医药、化工等领域有着广泛的应用价值。来源于Anabaena sp.PCC7120的脂肪氧合酶(Ana-LOX)因为其热稳定性差，制约了其在工业生产中的应用。因此对Ana-LOX进行热稳定性改造具有重要的意义和应用价值。 本文对Ana-LOX进行三维结构模拟分析，选择合适突变位点进行分子改造研究，利用定点突变获得热稳定性提高的突变酶，对其进行酶学性质测定。通过对突变酶的三维结构进行分析，解析突变酶热稳定性提高的分子机制。对优势突变体进行发酵条件优化，并将突变酶应用于三苯甲烷类染料脱色研究。主要研究结果分述如下: 1.三维结构模拟和突变位点选择 首先，对Ana-LOX基因序列进行多序列比对，利用SWISS-MODEL对Ana-LOX进行同源建模，模拟其三维结构。通过模型质量评估，发现有90.8％的残基分布于最佳合理区，而只有1.7％的残基出现在不合理区。其次，利用B-Fitter软件分析Ana-LOX三维结构模型PDB文件，获得B-值最高的20个氨基酸残基。通过分析发现Ana-LOX高度柔性位点（B值前十的氨基酸残基）主要集中在以下2个区域:422区域和140区域。并且分析发现422区域和140区域分别处于Ana-LOX结构的C-末端和Loop环上。最后，利用3DM-database结构保守性分析及DNAMAN对的Ana-LOX氨基酸序列进行比对，选择422区域突变点为:N419H、N419Q、N419A、V421S、V421A、V421G;利用理性设计中构建盐桥的策略选择140区域突变点为:G139D、Q155E、N156D。 2.利用定点突变提高脂肪氧合酶的热稳定性 根据预测的突变位点，设计引物，通过定点突变获得突变体库。对突变体进行发酵表达、分离纯化以及酶学性质测定，获得热稳定性提高的优势突变体V421A、V40A和V421A/V40A。实验发现，野生酶在50℃下的半衰期（T1/2）为3.8 min，而突变酶V421A和V40A在50℃的半衰期分别为7.0 min和4.4 min。突变酶V421A/V40A的半衰期为8.3 min，与野生型Ana-LOX相比，提高了1.18倍。相对于野生酶，突变酶V421A、V40A和V421A/V40A的比活力分别提高了4.83％、41.58％、80.07％。突变酶的最适反应温度均比野生酶(35℃)高5℃。最适pH方面，野生酶和突变酶最适反应pH均为9.0。动力学参数上，突变酶V421A/V40A的Km相对野生酶显著降低，表明突变酶V421A/V40A相对野生酶与底物更具有亲和力;突变酶的催化速率(kcat)均高于野生酶，突变酶V421A的催化速率为野生酶的1.65倍。Fe2+对重组Ana-LOX具有强烈的激活作用，与对照组相比，提高30％左右;Fe3+和Cu2+对重组Ana-LOX有很强的抑制作用，能完全抑制Ana-LOX活性。 3.突变酶结构分析及热稳定性提高分子机制解析 首先，利用圆二色谱对突变酶的结构进行分析，结果显示重组酶的β折叠没有明显的改变，而突变酶V421A和V421A/V40A的α螺旋含量相对野生酶分别提高了4.6％和9.4％。其次，利用荧光光谱对重组酶的疏水性进行分析发现，突变酶V40A由缬氨酸突变成疏水性低的丙氨酸，从而导致突变酶V40A的蛋白表面疏水性降低，热稳定性提高。利用差示量热扫描野生酶和突变酶的热变性温度，与野生酶相比突变酶V421A、V40A和V421A/V40A的热变性温度分别提高了2℃、0.8℃、2.6℃。最后，通过SWISS-MODEL对突变酶进行同源建模，模拟其三维结构，与野生酶结构进行比较发现，421位的缬氨酸破坏了V421所处的整个α螺旋的完整性。利用Ala替换掉α螺旋中β侧链较大的缬氨酸提高了421位α螺旋的稳定性。同时突变使得V421A突变点相邻的侧链55位到70位由无规则卷曲形成了一段新的α螺旋，使得突变体V421A在热稳定性方面更加稳定。而V40位于结构的N-末端，处于酶蛋白分子的表面，降低酶分子表面氨基酸疏水性可以增强蛋白的热稳定性，突变酶V40A将缬氨酸突变成疏水性低的丙氨酸从而提高酶蛋白热稳定性。 4.突变酶发酵条件优化及三苯甲烷类染料脱色的研究 首先，对优势突变体Ana-LOX-V421/V40进行发酵条件优化。通过培养基优化，确定TY培养基对突变体V421/V40表达效果最佳，此时酶活达到最高8836 U/mL。通过培养条件优化，加入0.1g/L IPTG后，随着诱导时间的增加，酶活呈先上升后下降的趋势，在诱导时间12h时产量达到7902 U/mL;当茵体OD600为0.4时，突变体V421/V40酶活最高，达到8453 U/mL;在IPTG终浓度为0.1 g/L时，突变体V421/V40酶活达到最高8587 U/mL。其次，Ana-LOX应用于三苯甲烷类染料脱色研究:混合Ana-LOX和亚油酸的实验组c反应体系具有明显的脱色效果;突变酶V421A/V40A在45℃反应条件下对苯胺蓝和亮绿分别具有85.34％和74.51％的催化效率，而在45℃下野生酶对这两种染料的催化效率分别为71.11％和35.52％，结果表明在一定的高温条件下突变酶相对野生酶能够保持更高的催化能力，同时也证明了突变酶比野生酶具有更好的热稳定性。最后，摸索苯胺蓝和亮绿HPLC流动相条件:苯胺蓝选择乙腈-50mM醋酸-醋酸铵(pH4.5)缓冲液作为流动相，而亮绿选择乙腈-20 mM醋酸-醋酸铵(pH4.5)缓冲液作为流动相。利用HPLC分析，对苯胺蓝溶液10h的脱色能力达到0.0827 mg·U-1·h-1;对亮绿溶液10h的脱色能力达到0.1609 mg·U-1·h-1。