【摘 要】
：
目的：构建TBC1D15 基因敲除细胞系并进一步研究其功能.方法：(1)SgRNA 序列设计：应用http：//crispr.mit.edu/设计针对TBC1D15 第五个外显子的一对最优gRNA,标记为a、b,根据获得的gRNA 序列设计互补引物,并在两端增加Bpi I 的酶切位点.(2)重组质粒pX462-TBC1D15-1a 和pX462-TBC1D15-1b 的构建与鉴定：用Fast Di
【机 构】
：
浙江理工大学生命科学学院,杭州310000;浙江省家蚕生物反应器和生物医药重点实验室,杭州310000
【出 处】
：
中国生物化学与分子生物学会2016年全国学术会议
论文部分内容阅读
目的：构建TBC1D15 基因敲除细胞系并进一步研究其功能.方法：(1)SgRNA 序列设计：应用http：//crispr.mit.edu/设计针对TBC1D15 第五个外显子的一对最优gRNA,标记为a、b,根据获得的gRNA 序列设计互补引物,并在两端增加Bpi I 的酶切位点.(2)重组质粒pX462-TBC1D15-1a 和pX462-TBC1D15-1b 的构建与鉴定：用Fast Digest BpiⅠ对pX462 进行酶切,用T4 ligase 将线性的pX462 质粒载体分别与互补引物逐步退火产物后进行链接,连接产物转化后涂板、挑斑培养后送去测序,测序正确的克隆提取重组质粒.(3)细胞转染、筛选：MTT 法筛选获得90％Hela 细胞致死时嘌呤霉素浓度后,消化Hela 细胞,按一定密度接种于6 孔板中,以备次日转染.将Lipo3000转染试剂和DMEM 混合,重组质粒pX462-TBC1D15-1a 和pX462-TBC1D15-1b 分别与DMEM 及lipo3000 辅助转染试剂混合,随后将Lipo3000 转染试剂混合物与重组质粒混合物混合,室温孵育5 min 后加入培养基中.培养48 h 后加入嘌呤霉素筛选.筛选48 h 后消化细胞,用有限稀释法将细胞按一定密度接种于96 孔板中,每隔2 天换一次培养基,获得单细胞.(4)基因敲除细胞系的鉴定及功能研究：单细胞扩大培养后,通过Western Blotting 及RT-PCR 分别检测TBC1D15 蛋白转录及表达,基因组PCR 并测序检测靶定位点基因组序列变化.通过形态学比较、细胞核及细胞骨架染色,比较TBC1D15 基因敲除后对细胞的影响.结果：1μg/mL 时Hela 细胞有90％的致死率,因此,在后续筛选细胞系中使用嘌呤霉素浓度1μg/mL(Helacell)来处理细胞.筛选出来的单克隆细胞,从形态学上来讲,TBC1D15 基因敲除后的Hela 细胞有明显的变化,Western blotting 结果显示挑选出来的单克TBC1D15 不表达.结论：成功获得一株TBC1D15 基因敲除的Hela 细胞系,且TBC1D15 基因敲除后对细胞形态有影响,有助于进一步研究TBC1D15 可能参与的信号途径.
其他文献
The maladjustment of pro-inflammatory and anti-inflammatory had been acknowledged as one of the chief causations of inflammatory diseases and even cancers.Previous studies showed that plant-derived bo
Purpose:The aim of the study was to investigate the expression of mitogen activated protein kinase p38(p38MAPK),nuclear transcription factor kappa B(NFκ B)and tumor necrosis factor-α(TNF-α)in rats wit
Molecular imaging is powerful tool to explore the distribution or the function of a given target,thus has drawn significant attention in the fields of chemical biology and disease diagnosis.CD22 is a
HBeAgases 是一组蚯蚓蛋白酶,具有降解纤连蛋白和乙型肝炎e 抗原的作用。免疫组织化学的结果显示,HBeAgases 由蚯蚓的上消化道产生,定位于环节之上的消化道系统内。为了研究HBeAgases 在肠道内的吸收,本文作者研究了这些蛋白酶在肠壁和血液内的分布。采用HBeAgases 喂食小鼠,通过EFE-Ⅲ-1 的抗体进行标记可以观察到,HBeAgases 分布在胃肠壁的囊泡内,蛋白酶的含量
In this study,Candida albicans was selected to study the antifungal activity of composite medicinal plant extracts(CMPEs),which was composed of Carthamus tinctorius,Lithospermum erythrorhizon,Solanum
Innate Lymphoid Cells(ILC)were newly discovered cells that existed between innate and adaptive immunity,which can be divided into ILC1,ILC2 and ILC3.It had been reported that ILC3s can influence the i
Vegetative insecticidal proteins(Vips)secreted by Bacillus thuringiensis(Bt)strains during the vegetative growth stage,were seemed as the second generation of Bt insecticides.A number of Bt isolates w
Major depressive disorder is a neuropsychiatric disorder with few approaches.The application of nontargeted antidepressants induced many adverse effects including sexual dysfunction,cardiotoxicity and
Cellulase has been applied in industry,agriculture,food,medicine and other fields.It is difficult for individual cellulase to degrade natural cellulose,and cocktailed cellulase from different cellulas
扩张床吸附(Expanded bed adsorption)是一种新型生物分离方法,把下游过程中的固液分离、浓缩和初步纯化集成于一个单元操作,减少操作步骤,提高产品收率,降低分离费用,在蛋白质、抗体、酶及基因工程药物的分离纯化中具有广阔的应用前景.扩张床吸附最重要的特征是床层内稳定的轴向分级分布,本文针对新型喷嘴型扩张床,采用在线取样方法,比较不同介质和蛋白吸附的轴向分布特征,为设计新型扩张床及介