为探讨长期不同施肥模式对农牧交错带旱地土壤微生物多样性和群落结构的影响，以农业农村部内蒙古耕地保育科学观测试验站的长期定位施肥试验为研究对象，选取不施肥（CK）、单施氮肥（NF）、单施化肥（CF）和有机肥+化肥配施（CFM）这4个处理，于试验开展16a后（2019年）的马铃薯成熟期分取各处理0～10 cm和10～20 cm土层土壤，利用高通量测序技术对土壤细菌和真菌群落进行测定，以期从微生物的角度探究农田不同施肥措施对土壤质量的影响，并通过结构方程模型（PLS-PM）揭示了施肥模式转变中旱地土壤微生物群落演替和作物产量提升的关键环境驱动因子。结果表明：①CF和CFM处理均改善了土壤肥力，但后者效果明显优于前者，CFM处理土壤碱解氮、有效磷和速效钾分别提高131.79%～164.39%、219.66%～288.26%和103.31%～109.30%，有机质和全氮也显著增加；CF处理仍保持了较高的土壤pH，而NF处理土壤pH显著降低，对土壤肥力的提升效果微弱。②与CK相比，NF处理显著降低了土壤细菌的Chao1和Shannon指数，CFM处理显著增加了细菌的物种丰富度（OTU）、Chao1指数和土壤真菌的Shannon指数，而CF处理土壤细菌和真菌的多样性与CK处理间未达到显著差异水平。③0～10 cm和10～20 cm土壤微生物的群落组成相似，CFM处理提高了土壤有益菌群的相对丰度，降低了病原菌群的相对丰度，变形菌门（Proteobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）和芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）等优势菌门的相对丰度增加，放线菌门（Actinobacteria）和子囊菌门（Ascomycota）和担子菌门（Basidiomycota）的相对丰度降低，NF和CF处理则与之相反。④PLS-PM分析表明，随着施肥模式由CK→NF→CF→CFM的转变，影响微生物群落演替和产量提升的主要驱动因子也由土壤pH→土壤NPK含量→土壤pH、SOM和NPK含量的环境多因子调控转变。总体而言，长期施肥对农牧交错带旱地土壤化学性质和微生物群落有显著影响，作为最优施肥选择，CFM在提高土壤肥力和抑制病原微生物生长方面明显优于NF和CF处理，长期不施肥和不均衡施肥土壤中病原菌数量明显提高，作物侵染土传病害的风险增加。研究结果可为北方农牧交错带农田养分平衡管理和农业生态系统土壤微环境改善提供科学参考。