目的:探讨破骨细胞传代、冻存与复苏的可行性,为开展破骨细胞的相关研究提供新的技术手段与方法。方法:破骨细胞的传代:取成年SPF级雄性SD大鼠1只,体重250 g,腹主动脉采血,分离周围血单个核细胞,经RANKL、M-CSF诱导培养2周,形成多核破骨细胞后,采用胰蛋白酶消化、震荡、吹打法,制成细胞悬液,离心后用含RANKL、M-CSF的α-MEM完全培养基重悬,接种至6孔培养板与直径35 mm培养皿中。破骨细胞的冻存:取上述细胞悬液,离心后用DMSO、FBS、α-MEM(1∶2∶7)冻存液,按常规程序将细胞冻存于-196℃液氮中。破骨细胞的复苏:从液氮中取出冻存的破骨细胞,37℃水浴中快速解冻,加PBS离心清洗后,用含RANKL、M-CSF的α-MEM完全培养基重悬,接种至6孔细胞培养板与直径35 mm培养皿中。同时对传代与复苏培养中破骨细胞的消化与贴壁过程,采用倒置相差显微镜与活细胞工作站进行观察记录与动态成像,3 d后作TRAP染色。结果:破骨细胞经胰蛋白酶消化、震荡、吹打后,细胞基本上脱壁、悬浮,可以制成细胞悬液,用于传代与冻存。破骨细胞传代培养后,大多在2 h内开始贴壁,贴壁后胞内细胞核清晰可见。经液氮冻存的破骨细胞,复苏培养后2~3 h开始贴壁,胞质展开,可见多个细胞核。传代与冻存复苏培养后的破骨细胞,TRAP染色呈阳性反应。结论:破骨细胞虽然贴壁比较牢固,但经适当的消化、震荡及吹打,多数可脱壁悬浮,并能实现传代培养,同时还可采用常规方法进行细胞冻存与复苏培养,经传代与冻存的破骨细胞仍可保持破骨细胞的活性。破骨细胞的传代与冻存,可以按实验计划与用量需求,随时进行分量传代与复苏培养,为开展破骨细胞的相关研究提供新的技术手段与方法。