探讨慢病毒介导短发夹RNA(shRNA)沉默神经导向分子5A(Semaphorin 5A)基因对恶性黑素瘤A375细胞系生物活性的影响。
方法针对Semaphorin 5A设计2对shRNA引物及1对阴性对照引物，构建慢病毒载体，转染至人胚肾上皮HEK293T细胞系收获慢病毒，利用慢病毒感染A-375细胞系并通过嘌呤霉素筛选，成功获得稳定转染细胞系，实验分为实验组细胞(A375-shRNA1和A375-shRNA2)、阴性对照组细胞(A375-con)及空白对照组细胞(A375)。通过反转录PCR(RT-PCR)、Western印迹比较实验组细胞、阴性对照组细胞及空白对照组细胞Semaphorin 5A mRNA、蛋白表达水平的差异。噻唑蓝(MTT)检测细胞生长情况；侵袭试验及划痕试验比较转染前后细胞的侵袭运动能力。
结果Semaphorin 5A成功转染A375细胞后，经嘌呤霉素筛选，成功获得稳定转染实验组A375-shRNA2细胞系及对照组A375-con。反转录PCR及Western印迹检测，干扰后实验组A375-shRNA2较对照组A375-con、A375 Semaphorin 5A的转录水平及蛋白表达水平表达下调。MTT实验结果显示，A375-con与A375细胞生长差异无统计学意义(P > 0.05)，A375-shRNA2细胞生长明显减慢，与A375和A375-con比较，差异均有统计学意义(P < 0.05)。划痕实验结果显示，A375-shRNA2划痕处细胞无明显迁移，划痕未得到修复，而A375及A375-con划痕处细胞最终几乎将划痕覆盖。侵袭实验结果显示，A375组与A375-con组穿过的细胞数差异无统计学意义(P > 0.05)；而A375-shRNA2通过小室的细胞明显少于A375及A375-con组，差异有统计学意义(P < 0.05)。
结论慢病毒介导shRNA沉默Semaphorin 5A基因能使A375中的Semaphorin 5A有效下调，并抑制细胞的生长，降低细胞的侵袭以及运动能力。