本文我们首先研究了14-3-3δ基因在动物细胞中的一些表观遗传特性，其次我们还向A549细胞株中引入siRNA，对比了siRNA引入前后A549细胞株中14-3-3δ基因表观遗传模式的改变情况，通过本课题的研究，主要得到以下结论：1.14-3-3δ基因的表达具有组织特异性，这种表达的组织特异性受表观遗传因素的控制，其启动子区DNA的高甲基化、组蛋白的去乙酰化会抑制基因的表达；2.这段与14-3-3δ基因启动子区同源的siRNA诱导14-3-3δ基因启动子区表观遗传模式的改变，诱导了14-3-3δ基因启动子区CpG岛的再甲基化，引发了该区域组蛋白的去乙酰化反应，14-3-3δ基因表观遗传模式的改变引发了基因表达的下降。本课题的完成将有助于阐明动物细胞中siRNA诱导甲基化的机制，为肿瘤的治疗提供新的方法提供实验数据和理论依据。 表观遗传学(epigenetics)这个术语最早是由ConradWaddington于上个世纪40年代提出，ConradWaddington用它来描述基因与其环境的关系。起初，表观遗传学的主要研究内容是描述了异染色质(heterochromatin)这种基因组形式，其主要特点是低基因密度、高重复序列和细胞周期过程中最晚复制。接着，表观遗传研究发现异染色质和常染色质(euchromatin)的差别是与DNA甲基化(DNAmethylation)和组蛋白修饰密切相关，并且发现这种差别决定了基因活性的特定状态，由此引出了表观遗传密码(epigeneticcode)这个概念，表观遗传密码决定了染色质的状态，从而影响基因的表达。最近的研究发现了一种表观遗传记忆系统(epigeneticmemousystem)，这是一个由蛋白pcG和trxG介导用于保持染色质沉默状态的系统，shRNAs(shorthairpinRNAs)通过RNAi途径在异染色质形成中发挥了很重要的作用。基因表达的可遗传改变比如发生在植物中的副突变、哺乳动物中的X染色体失活、基因印迹(genomicimprinting)等这些基因沉默现象预示了个体中复杂的基因表达调控，根据目前该领域的研究现状，可以将表观遗传学的主要研究内容和学科范畴简单描述为：不发生核酸序列改变的基因表达可遗传改变的研究。 表观遗传现象是多细胞生命中普遍存在的一种现象，多细胞生命体在发育过程中，各种组织细胞的基因表达谱不断发生重构改变，这一系列重构变化并没有伴随着基因组DNA序列的改变，而是涉及到DNA环境的改变，这些DNA环境包括：染色质折叠形式、DNA所处的核位置、核小体包装形式、组蛋白尾巴的共价修饰(如乙酰化、甲基化、磷酸化等)、DNA甲基化。其中DNA甲基化被认为是影响表观遗传的主要因素，自从1948年被首次发现以来，DNA甲基化就引起科学界的浓厚兴趣，5-mC甚至被称为基因组的第五个碱基。DNA甲基化在细胞生物学过程中发挥了重要作用，主要体现在以下几个方面：调节组织特异型基因表达、基因印迹、X染色体失活、肿瘤相关基因表达沉默、抑制转座元件(transposableelements)和内源反转录病毒(endogenousretroviruses)的活性、甲基化外源插入DNA序列起到防御作用等。 个体在发育过程中，表观遗传密码是如何建立并随着发育的过程中按程序化重构至今仍是个迷。研究发现siRNA在这个过程中发挥了重要的作用，其中siRNA指导的DNA甲基化是基因组表观修饰改变的重要形式，这个过程被称为RNA指导的DNA甲基化(RdDM，RNA-directedDNAmethylation)，该现象首先发现于植物系统中，siRNA在植物中可以指导DNA甲基化，但在哺乳动物中却很少报道，但是动物细胞中也存在着一些与RdDM类似的组分如DNA甲基转移酶(DNMT)、Dicer蛋白等。2004年HiroakiKawasaki和KevinVMorris两个小组分别在动物细胞中诱导了有意义的DNA甲基化，这些siRNA在转录水平抑制了靶基因的表达，这些研究工作预示在动物中也存在和植物中类似的RdDM。 siRNA研究现在已经成为生命科学研究的热点，研究发现siRNA广泛参与了细胞的分化发育等过程，RdDM就是siRNA参与表观遗传控制的一种形式，siRNA通过RdDM方式调控基因的表达，调节细胞的功能。虽然在动物细胞中也发现了RdDM现象，但是RdDM在动物细胞中是否普遍存在，其发挥作用的机制是什么还是很模糊。为了解决这些问题，本课题拟选择一个基因为模型研究动物细胞中的RdDM现象，以期探索动物细胞中RdDM的机制，以及其真实存在的证据。 DNA甲基化模式的改变是肿瘤发生中起着重要的作用，由此产生转录水平的基因沉默直接导致了抑癌基因的失活。肿瘤细胞中siRNA很可能作为信号诱导了抑癌基因的甲基化，从siRNA诱导的甲基化途经入手，阻断siRNA诱导的通路，将可能抑制抑癌基因的甲基化，也许会找出肿瘤治疗的新方法，抑制肿瘤细胞中DNA异常甲基化的研究将会给肿瘤的治疗研究带来更广阔的前景，更多的药物和治疗方法将会在这个领域诞生。 第一部分模式基因的选择以及细胞模型的选择本研究所选择的基因应该满足以下条件：1，基因属于组织特异性表达的基因；2，基因的特异性表达是受表观遗传因素控制。14-3-3σ基因是一种表皮组织来源细胞特异性表达的基因，但是在一些表皮组织来源的肿瘤细胞中其表达是关闭的，2000年AnneT.Ferguson小组的研究发现这种基因沉默是由于14-3-3σ基因启动子区CpG岛(CpGisland)的甲基化引起，所以本实验选择了14-3-3σ基因作为模式基因。 同样本研究所选择的细胞模型也应该具备以下条件：1，阴性对照细胞，在该细胞中14-3-3σ基因是不表达的；2，阳性对照细胞，该细胞中14-3-3σ基因是表达的，而且这种基因沉默或开放是由于表观遗传因素控制。通过RT-PCR检测细胞cDNA的方法，检测了多种细胞中14-3-3σ基因的表达情况，我选择了293T和人肺癌细胞A549这两种细胞作为细胞模型，因为14-3-3σ基因在293T细胞中不表达或者说很微弱表达，通过亚硫酸氢盐处理测序(bisulphite-modifiedDNAsequencing)的方法证明其启动子区CpG岛完全处于甲基化状态，同样方法证明在A549细胞中14-3-3σ基因是表达的，其启动子区CpG岛完全处于去甲基化状态。通过免疫共沉淀后PCR的方法检测了14-3-3σ基因CpG岛区域组蛋白修饰的改变情况，检测了组蛋白H3的乙酰化状态，结果显示，在293T细胞中14-3-3σ基因CpG岛区域组蛋白H3处于去乙酰化状态，A549细胞14-3-3σ基因CpG岛区域组蛋白H3处于乙酰化状态。 以上实验确定了本实验的模式基因为14-3-3σ基因，并且确定了两种细胞模型为293T细胞和A549细胞，从而为下一步研究工作的开展奠定了基础。 第二部分shRNA诱导14-3-3基因启动子甲基化与基因表达沉默为了研究RdDM对14-3-3σ基因启动子区甲基化模式以及表达的影响，本研究选择了一段20bp的序列作为siRNA的模板，将这段siRNA设计成shRNA形式构建入siRNA表达载体pSuppressorNeo，转入A549细胞，G418筛选后得到A549细胞shRNA稳定筛选株(shRNA-A549)，抽取mRNA和DNA，定量PCR检测14-3-3σ基因的表达，发现在A549细胞shRNA稳定筛选株中14-3-3σ基因的表达水平与其在正常野生型A549细胞(wt-A549)中表达相比下降了50％左右；使用5-aza-dC(甲基化转移酶抑制剂)和TrichostatinA(TSA，组蛋白去乙酰化抑制剂)分别对A549细胞shRNA稳定筛选株进行处理，定量PCR检测发现14-3-3σ的表达上调，恢复甚至超过了其在正常野生型A549细胞中的表达水平，由此可以初步确定A549细胞shRNA稳定筛选株中14-3-3σ的表达下调是由于表观遗传改变而引起。 通过亚硫酸氢盐处理后测序的方法检测了A549细胞shRNA稳定筛选株中14-3-3σ基因CpG岛甲基化模式的改变情况，结果发现24个CpG位点中有19位点发生了重新甲基化。 通过免疫共沉淀后PCR的方法检测了14-3-3σ基因CpG岛区域组蛋白修饰的改变情况，检测了组蛋白H3的乙酰化状态，结果显示A549细胞shRNA稳定筛选株中14-3-3σ基因CpG岛区域组蛋白H3发生了去乙酰化改变。 实验中我们还设计了对照组，对照组中相对于正常A549细胞以上研究均没有检测到改变现象。 以上结果证实shRNA确实引起了14-3-3σ基因表观遗传修饰的改变，这种改变直接影响了14-3-3σ基因的表达，引发了基因沉默现象。 本课题的完成将有助于阐明动物细胞中siRNA诱导甲基化的机制，为肿瘤的治疗提供新的方法提供实验数据和理论依据。