【目的】在生物学研究及生物制品生产中易发生支原体污染，针对我国当前支原体检验方法在时效性和敏感性上的不足，建立一种简便快速、特异敏感的支原体检验PCR方法。【方法】从SILVA数据库下载包含全部细菌、古菌和真菌的核糖体rRNA小亚基（16S/18S, SSU）参考序列的库文件SILVA＿123＿SSURef，从中提取全部支原体序列，经去重复后得到181条（种）支原体（包括139个已分类的单一种类和42个未分类的支原体）的16S rRNA序列，经比对后选取高变区V6到V9为检测目标区段，设计筛选出表现最佳的检测引物，建立检测支原体的通用PCR方法。选取12种常见的支原体或2种甾原体作为待检样品对该PCR方法进行检测范围验证；取6种不同动物来源的常用传代细胞和3种常见细菌进行特异性验证；选取了5种最常见的支原体和1种甾原体进行敏感性试验；并将其与经典培养法一同对17批（种）动物病毒活疫苗（分别用于6种动物）和24份8种细胞培养物样本进行对比检测以评价其实际应用效果。【结果】建立了一种通用的支原体PCR检测方法，检测引物由2条上游引物（5′-GCAAARCTATRGARAYATAGYVGAG-3′和5′-GCAAAGGCTTAGAAATAAGTTCGGAG-3′）和1条下游引物（5′-CCARCTCYCATRGTKTGACGG-3′）组成，引物配比为3﹕1﹕4，最佳退火温度为56℃。采用该PCR方法对14个较常见的支原体种类进行检测，结果均能扩增出396—413 bp大小的特异性条带，表明该方法的检测范围符合检测要求；对6种动物传代细胞和3种常见细菌进行检测，结果均未扩增出特异性条带，表明其特异性良好；灵敏度测定结果表明该PCR方法的检测下限可达20—200 CCU的活菌，对应的核酸为1.5—15.0 pg；对共计17批病毒活疫苗和24份细胞样品的检测结果与培养法检测结果基本一致，表明本研究建立的支原体PCR检测方法与培养法有很好的一致性，而且敏感性更高。【结论】建立的支原体PCR检测方法特异性强、敏感性高、重复性好、简单快速，为细胞及病毒活疫苗中可能的支原体污染提供了一种准确可靠的快速检测方法。