论文部分内容阅读
摘要：目的 观察中药复方糖痹康对糖尿病周围神经病变大鼠血浆β-内啡肽（β-EP）含量的影响，探讨其镇痛及神经保护机制。方法 采用高脂饲料和小剂量链脲佐菌素（STZ）诱发2型糖尿病大鼠动物模型，造模后随机分为模型组、甲钴胺组及糖痹康高、中、低剂量组，另设10只大鼠为正常组。模型组和正常组给予等量蒸馏水，各治疗组给予相应药物灌胃，每4周检测体质量、空腹血糖，16周后取大鼠一侧坐骨神经，光镜观察各组大鼠坐骨神经病理变化，并用放射免疫法检测大鼠血浆β-EP变化。结果 治疗16周后，糖尿病大鼠体质量、血糖明显改善。与模型组比较，甲钴胺组及糖痹康各剂量组能明显改善糖尿病周围神经病变大鼠坐骨神经病理组织学损伤程度。与正常组比较，模型组β-EP表达显著降低（P<0.01）；与模型组比较，糖痹康中、高剂量组显著增加β-EP表达（P<0.01）。结论 糖痹康能降低糖尿病大鼠血糖，上调糖尿病周围神经病变大鼠血浆β-EP水平，对坐骨神经的形态具有保护作用。
关键词：糖痹康；糖尿病；周围神经病变；坐骨神经；β-内啡肽；大鼠
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2014）04-0049-04
糖尿病周围神经病变（DPN）是临床发病率较高的糖尿病并发症之一。据世界卫生组织估计，到2030年全世界大约有3.6亿糖尿病患者，其中绝大多数是2型糖尿病患者且大约一半以上有DPN症状[1]。临床研究表明，糖痹康具有镇痛作用[2]。本实验通过高脂饲料和小剂量链脲佐菌素（STZ）诱发糖尿病构建2型DPN动物模型，观察糖痹康对大鼠血浆β-内啡肽（β-EP）的影响，进一步揭示糖痹康镇痛作用及神经保护机制。
1 实验材料
1.1 动物
选取SPF级SD雄性大鼠60只，6周龄，体质量（160±10）g，动物许可证号：SCXK（京）2004-0009，购自北京维通利华动物实验中心。
1.2 药物与饲料
糖痹康（黄芪、女贞子、桂枝、黄芩、黄连等），北京中医药大学中药学院提供；甲钴胺片（国药准字H20030812），卫材（中国）药业有限公司产品。高脂饲料，购自北京华阜康生物科技有限公司。
1.3 主要试剂与仪器
β-EP放射免疫试剂盒（北京华力特生物技术研究所）；罗氏活力型血糖仪，ACCU-CHEK；100 ℃水浴锅（北京市医疗设备厂）；CHA-S恒温气浴箱（常州国华）；混匀器SK-1（常州国华）；FS-2可调高速匀浆机（常州国华）；LG16-W可调离心机（北京市医疗设备厂）。
2 实验方法
2.1 造模与分组
动物适应性喂养1周。随机选取10只为正常组，普通饲料喂养；其余予高脂饲料，8周后腹腔内注射STZ 35 mg/kg造模。72 h后用血糖仪测尾尖血血糖，持续血糖≥16.7 mmol/L为造模成功，随机分为模型组、甲钴胺组及糖痹康低、中、高剂量组，每组10只。
2.2 给药
血糖稳定3 d后，糖痹康低[4.175 g/（kg·d）]、中[8.35 g/（kg·d）]、高[16.7 g/（kg·d）]剂量组分别按成人剂量5、10、20倍给药，甲钴胺组按成人剂量10倍给药，每日1.97 mg/kg。实验期间大鼠自由进食饮水，连续给药16周。
2.3 指标检测
2.3.1 体质量、血糖检测 分别在给药前和给药后4、8、12、16周，禁食6 h，称体质量，尾静脉取血测空腹血糖。
2.3.2 组织病理学观察 给药后16周末，取2 cm左右大鼠坐骨神经，放入4%多聚甲醛（不含DEPC）固定，石蜡包埋，4 μm切片，待做HE染色，光镜下观察坐骨神经组织病理学变化。
2.3.3 血浆β-内啡肽含量检测 给药16周后，各组大鼠按0.4 mL/100 g剂量10%水合氯醛腹腔注射麻醉，腹主动脉采血2 mL，立即置入预冷的含7.5% EDTA 30 μL和抑肽酶40 μL的无菌采血管中，混匀，-4 ℃ 3000 r/min离心10 min，分离血浆，放入-80 ℃低温冰箱待用。放射免疫法测定血浆β-EP含量，按试剂盒说明书步骤操作。
3 统计学方法
采用SPSS16.0统计软件进行分析。实验数据用—x±s表示，组间比较采用方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。
4 结果
4.1 一般情况
STZ注射72 h后，大鼠逐渐出现不同程度的觅食量增加，尿量明显增多，消瘦，精神不振，体毛色泽枯黄，缺乏光泽，竖毛弓背，活动明显迟缓，反应迟钝。后期还相继出现多种糖尿病并发症，如溃疡、白内障等。
4.2 体质量变化
给药8、12、16周后，模型组大鼠体质量较正常组降低（P<0.05，P<0.01）；干预16周后，糖痹康低、中剂量及甲钴胺组体质量显著升高（P<0.01）。见表1。
4.3 糖痹康对大鼠血糖的影响
给药前及给药后各时间点模型组大鼠血糖显著升高（P<0.01）；与模型相比较，各治疗组大鼠血糖均有不同程度的下降（P<0.05，P<0.01）。见表2。
4.4 病理观察
正常组大鼠坐骨神经纤维结构紧密、分布均匀、排列整齐，半月形施万细胞且其结构完整，髓鞘薄厚均匀、着色均匀粉染；模型组大鼠坐骨神经纤维排列疏松、间隙变大、多处发生变性及断裂，有髓神经纤维密度分布不均匀且显著减少，髓鞘变薄且着色不均匀，出现大量炎性病灶；与模型组比较，甲钴胺组大鼠坐骨神经的变性与断裂显著减少，神经纤维结构紧密，但髓鞘仍较薄且着色不均匀，局部仍有炎症反应发生；糖痹康低、中剂量组大鼠坐骨神经纤维变性与断裂显著减少，但结构仍较疏松，髓鞘无显著变化，局部仍有炎症反应发生，而糖痹康高剂量组大鼠坐骨神经纤维结构紧密、排列整齐，未见变性与断裂的发生，髓鞘变厚且着色均匀，炎性病灶相对减少。见图1。 4.5 糖痹康对大鼠血浆β-内啡肽含量的影响
模型组大鼠血浆中β-EP含量显著降低（P<0.01）；甲钴胺组及糖痹康中、高剂量组大鼠血浆中β-EP含量较模型组显著升高（P<0.01）。见表3。
5 讨论
中医学认为，DPN属于“消渴”继发“痹证”、“痿证”。近年来，中医对DPN的病机研究取得了较为一致的认识，即乃气阴两虚、瘀血阻络。阴亏是DPN发生的关键，气虚是迁延不愈的症结，阳虚是发展的必然趋势，血瘀是造成本病的主要原因。
中药复方糖痹康是在传统经方黄芪桂枝五物汤（《金匮要略·血痹虚劳病脉证并治》）基础上，结合现代研究成果和临床经验创制的，经多年临床验证，不断优化处方，其组方及制备工艺已申报发明专利（专利申请号：200810167551.1）。既往研究表明，糖痹康能提高STZ诱导的DPN大鼠周围神经传导速度，改善神经病理，对DPN有一定的保护作用，升高血清超氧化物歧化酶、一氧化氮合酶、一氧化氮含量，降低坐骨神经晚期糖基化终末产物的含量，减轻氧化应激造成的周围神经损害，具有抗氧化应激的作用[3-6]。
β-EP作为体内主要的内阿片肽，主要分布于下丘脑-垂体轴。在中枢神经系统的调节疼痛信号传递机制中，β-EP是对其进行调节的抑制性递质，可抑制痛觉传导递质P物质的释放，从而抑制初级感觉神经元至脊髓与三叉丘系的痛觉传递，最终产生吗啡样镇痛作用。2型糖尿病患者血浆中β-EP含量降低，DPN患者血浆中β-EP降低更为明显[7]。这是由于胰岛素分泌不足，致使正中神经传导速度减慢，从而降低β-EP的含量，最终导致疼痛阈值降低，疼痛明显加重[8]。
本研究结果显示，糖痹康对坐骨神经的形态具有保护作用。糖尿病大鼠血浆中β-EP的含量显著下降，糖痹康可显著上调糖尿病血浆中β-EP的表达。由此，我们推测，糖痹康对DPN的神经保护作用及镇痛作用有可能与其上调β-EP表达有关。
参考文献：
[1] Edwards JL， Vineent AM， Cheng HT， et al. Diabetic neuropathy：mechanisms to management[J]. Pharmaeol Ther，2008，120：1-34.
[2] 中华医学会糖尿病学分会慢性并发症调查组.1991-2000年全国住院糖尿病患者慢性并发症及相关大血管病变回顾性分析[J].中国医学科学院学报，2002，24（5）：447-451.
[3] 王佳，刘铜华.糖痹康对糖尿病大鼠血清神经性因子及坐骨神经神经性因子基因表达的影响[J].中国实验方剂学杂志，2010，16（6）：160-163.
[4] 王佳，刘铜华.糖痹康对糖尿病周围神经病变大鼠坐骨神经传导速度的影响[J].中国中医基础医学杂志，2010，16（3）：209-211.
[5] 穆晓红，刘铜华，秦灵灵，等.从血液流变学和坐骨神经传导速度评价中药糖痹康对大鼠糖尿病周围神经病变的影响[J].中华中医药杂志， 2012，27（2）：378-381.
[6] 张宏，刘铜华.糖痹康对高糖损伤人脐静脉内皮细胞的保护作用[J].中华中医药学刊，2012，30（6）：1248-1251.
[7] 刘彩艳，魏健，徐栋.鲑鱼降钙片治疗糖尿病周围神经病变疼痛及β-内啡肽变化[J].实用医药杂志，2004，21（3）：201-204.
[8] 沈祥峰，柴可夫，杨明华，等.运脾和络颗粒对糖尿病周围神经病变大鼠血浆β-内啡肽的影响[J].中华中医药学刊，2011，29（1）：125-127.
（收稿日期：2013-10-13，编辑：华强）
关键词：糖痹康；糖尿病；周围神经病变；坐骨神经；β-内啡肽；大鼠
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2014）04-0049-04
糖尿病周围神经病变（DPN）是临床发病率较高的糖尿病并发症之一。据世界卫生组织估计，到2030年全世界大约有3.6亿糖尿病患者，其中绝大多数是2型糖尿病患者且大约一半以上有DPN症状[1]。临床研究表明，糖痹康具有镇痛作用[2]。本实验通过高脂饲料和小剂量链脲佐菌素（STZ）诱发糖尿病构建2型DPN动物模型，观察糖痹康对大鼠血浆β-内啡肽（β-EP）的影响，进一步揭示糖痹康镇痛作用及神经保护机制。
1 实验材料
1.1 动物
选取SPF级SD雄性大鼠60只，6周龄，体质量（160±10）g，动物许可证号：SCXK（京）2004-0009，购自北京维通利华动物实验中心。
1.2 药物与饲料
糖痹康（黄芪、女贞子、桂枝、黄芩、黄连等），北京中医药大学中药学院提供；甲钴胺片（国药准字H20030812），卫材（中国）药业有限公司产品。高脂饲料，购自北京华阜康生物科技有限公司。
1.3 主要试剂与仪器
β-EP放射免疫试剂盒（北京华力特生物技术研究所）；罗氏活力型血糖仪，ACCU-CHEK；100 ℃水浴锅（北京市医疗设备厂）；CHA-S恒温气浴箱（常州国华）；混匀器SK-1（常州国华）；FS-2可调高速匀浆机（常州国华）；LG16-W可调离心机（北京市医疗设备厂）。
2 实验方法
2.1 造模与分组
动物适应性喂养1周。随机选取10只为正常组，普通饲料喂养；其余予高脂饲料，8周后腹腔内注射STZ 35 mg/kg造模。72 h后用血糖仪测尾尖血血糖，持续血糖≥16.7 mmol/L为造模成功，随机分为模型组、甲钴胺组及糖痹康低、中、高剂量组，每组10只。
2.2 给药
血糖稳定3 d后，糖痹康低[4.175 g/（kg·d）]、中[8.35 g/（kg·d）]、高[16.7 g/（kg·d）]剂量组分别按成人剂量5、10、20倍给药，甲钴胺组按成人剂量10倍给药，每日1.97 mg/kg。实验期间大鼠自由进食饮水，连续给药16周。
2.3 指标检测
2.3.1 体质量、血糖检测 分别在给药前和给药后4、8、12、16周，禁食6 h，称体质量，尾静脉取血测空腹血糖。
2.3.2 组织病理学观察 给药后16周末，取2 cm左右大鼠坐骨神经，放入4%多聚甲醛（不含DEPC）固定，石蜡包埋，4 μm切片，待做HE染色，光镜下观察坐骨神经组织病理学变化。
2.3.3 血浆β-内啡肽含量检测 给药16周后，各组大鼠按0.4 mL/100 g剂量10%水合氯醛腹腔注射麻醉，腹主动脉采血2 mL，立即置入预冷的含7.5% EDTA 30 μL和抑肽酶40 μL的无菌采血管中，混匀，-4 ℃ 3000 r/min离心10 min，分离血浆，放入-80 ℃低温冰箱待用。放射免疫法测定血浆β-EP含量，按试剂盒说明书步骤操作。
3 统计学方法
采用SPSS16.0统计软件进行分析。实验数据用—x±s表示，组间比较采用方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。
4 结果
4.1 一般情况
STZ注射72 h后，大鼠逐渐出现不同程度的觅食量增加，尿量明显增多，消瘦，精神不振，体毛色泽枯黄，缺乏光泽，竖毛弓背，活动明显迟缓，反应迟钝。后期还相继出现多种糖尿病并发症，如溃疡、白内障等。
4.2 体质量变化
给药8、12、16周后，模型组大鼠体质量较正常组降低（P<0.05，P<0.01）；干预16周后，糖痹康低、中剂量及甲钴胺组体质量显著升高（P<0.01）。见表1。
4.3 糖痹康对大鼠血糖的影响
给药前及给药后各时间点模型组大鼠血糖显著升高（P<0.01）；与模型相比较，各治疗组大鼠血糖均有不同程度的下降（P<0.05，P<0.01）。见表2。
4.4 病理观察
正常组大鼠坐骨神经纤维结构紧密、分布均匀、排列整齐，半月形施万细胞且其结构完整，髓鞘薄厚均匀、着色均匀粉染；模型组大鼠坐骨神经纤维排列疏松、间隙变大、多处发生变性及断裂，有髓神经纤维密度分布不均匀且显著减少，髓鞘变薄且着色不均匀，出现大量炎性病灶；与模型组比较，甲钴胺组大鼠坐骨神经的变性与断裂显著减少，神经纤维结构紧密，但髓鞘仍较薄且着色不均匀，局部仍有炎症反应发生；糖痹康低、中剂量组大鼠坐骨神经纤维变性与断裂显著减少，但结构仍较疏松，髓鞘无显著变化，局部仍有炎症反应发生，而糖痹康高剂量组大鼠坐骨神经纤维结构紧密、排列整齐，未见变性与断裂的发生，髓鞘变厚且着色均匀，炎性病灶相对减少。见图1。 4.5 糖痹康对大鼠血浆β-内啡肽含量的影响
模型组大鼠血浆中β-EP含量显著降低（P<0.01）；甲钴胺组及糖痹康中、高剂量组大鼠血浆中β-EP含量较模型组显著升高（P<0.01）。见表3。
5 讨论
中医学认为，DPN属于“消渴”继发“痹证”、“痿证”。近年来，中医对DPN的病机研究取得了较为一致的认识，即乃气阴两虚、瘀血阻络。阴亏是DPN发生的关键，气虚是迁延不愈的症结，阳虚是发展的必然趋势，血瘀是造成本病的主要原因。
中药复方糖痹康是在传统经方黄芪桂枝五物汤（《金匮要略·血痹虚劳病脉证并治》）基础上，结合现代研究成果和临床经验创制的，经多年临床验证，不断优化处方，其组方及制备工艺已申报发明专利（专利申请号：200810167551.1）。既往研究表明，糖痹康能提高STZ诱导的DPN大鼠周围神经传导速度，改善神经病理，对DPN有一定的保护作用，升高血清超氧化物歧化酶、一氧化氮合酶、一氧化氮含量，降低坐骨神经晚期糖基化终末产物的含量，减轻氧化应激造成的周围神经损害，具有抗氧化应激的作用[3-6]。
β-EP作为体内主要的内阿片肽，主要分布于下丘脑-垂体轴。在中枢神经系统的调节疼痛信号传递机制中，β-EP是对其进行调节的抑制性递质，可抑制痛觉传导递质P物质的释放，从而抑制初级感觉神经元至脊髓与三叉丘系的痛觉传递，最终产生吗啡样镇痛作用。2型糖尿病患者血浆中β-EP含量降低，DPN患者血浆中β-EP降低更为明显[7]。这是由于胰岛素分泌不足，致使正中神经传导速度减慢，从而降低β-EP的含量，最终导致疼痛阈值降低，疼痛明显加重[8]。
本研究结果显示，糖痹康对坐骨神经的形态具有保护作用。糖尿病大鼠血浆中β-EP的含量显著下降，糖痹康可显著上调糖尿病血浆中β-EP的表达。由此，我们推测，糖痹康对DPN的神经保护作用及镇痛作用有可能与其上调β-EP表达有关。
参考文献：
[1] Edwards JL， Vineent AM， Cheng HT， et al. Diabetic neuropathy：mechanisms to management[J]. Pharmaeol Ther，2008，120：1-34.
[2] 中华医学会糖尿病学分会慢性并发症调查组.1991-2000年全国住院糖尿病患者慢性并发症及相关大血管病变回顾性分析[J].中国医学科学院学报，2002，24（5）：447-451.
[3] 王佳，刘铜华.糖痹康对糖尿病大鼠血清神经性因子及坐骨神经神经性因子基因表达的影响[J].中国实验方剂学杂志，2010，16（6）：160-163.
[4] 王佳，刘铜华.糖痹康对糖尿病周围神经病变大鼠坐骨神经传导速度的影响[J].中国中医基础医学杂志，2010，16（3）：209-211.
[5] 穆晓红，刘铜华，秦灵灵，等.从血液流变学和坐骨神经传导速度评价中药糖痹康对大鼠糖尿病周围神经病变的影响[J].中华中医药杂志， 2012，27（2）：378-381.
[6] 张宏，刘铜华.糖痹康对高糖损伤人脐静脉内皮细胞的保护作用[J].中华中医药学刊，2012，30（6）：1248-1251.
[7] 刘彩艳，魏健，徐栋.鲑鱼降钙片治疗糖尿病周围神经病变疼痛及β-内啡肽变化[J].实用医药杂志，2004，21（3）：201-204.
[8] 沈祥峰，柴可夫，杨明华，等.运脾和络颗粒对糖尿病周围神经病变大鼠血浆β-内啡肽的影响[J].中华中医药学刊，2011，29（1）：125-127.
（收稿日期：2013-10-13，编辑：华强）