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摘要：目的 建立川芎药材的高效液相色谱指纹图谱。方法 使用色谱柱Thermo C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为甲醇-0.1%甲酸水溶液，梯度洗脱，柱温25 ℃，流速1.0 mL/min，检测波长323 nm。通过提取11个色谱峰作为指纹图谱共有峰，分别采用相似度评价，聚类分析和主成分分析等方法，对所收集的18批样品进行系统比较与归类。结果 通过比较18批川芎的色谱图，确定了11个共有峰，大部分样品的相似度在0.9以上，并将不同川芎分为3大类。结论 该方法重复性好，简便可靠，可以为川芎的质量控制和评价提供依据。
关键词：川芎；指纹图谱；高效液相色谱法
中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2014）04-0086-04
川芎为伞形科植物川芎Ligusticum chuanxiong Hort.的干燥根茎，主要栽培于四川、云南、贵州、广西、湖北等地。川芎始载于《神农本草经》，味辛、微苦、性温，具有活血祛瘀、行气开郁、祛风止痛之功，用于血瘀气滞所致的月经不调、痛经经闭，肝郁气滞而致血行不畅的胸胁疼痛、头痛，风寒湿痹、跌打肿痛等[1-2]。
现代化学和药理研究表明，川芎的活性成分主要包括挥发油类、酚酸类和生物碱类[3-4]，川芎的质量和道地性均与活性成分的含量和种类紧密相关。中药质量评价一直是中药研究与应用中的难点与重点问题，而建立在中药成分系统研究基础上的中药指纹图谱分析是一种综合、有效的评价手段，已成为国际公认的控制中药或天然药物质量最有效的方法之一[5-8]。为了更深入地研究并揭示川芎的质量差异，本试验对18个批次的川芎药材采用高效液相色谱法（HPLC）并结合“中药材指纹图谱相似系统”和SPSS统计软件进行分析，从而评价川芎药材的质量。 1 仪器与试药
美国Waters e2695高效液相色谱系统，包括在线脱气机，自动进样器Prominence SIL-20A，二极管阵列检测器Waters2998和柱温箱CTO-20A；Thermo C18 （250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱；Anke TGL-16C高速离心机（上海安亭科学仪器厂）；电子分析天平（FA1204B，上海精密科学有限公司）；恒温水浴锅（HH-2K6，巩义市予华仪器有限责任公司）。
阿魏酸对照品（批号110773-200611，纯度≥98%，中国药品生物制品检验所），甲醇（色谱纯，江苏汉邦科技有限公司），纯净水（杭州娃哈哈有限公司）。川芎对照药材（批号120927-200604，中国药品生物制品检验所）。川芎药材共18个批次，经南京中医药大学刘圣金老师鉴定为伞形科植物川芎Ligusticum chuanxiong Hort.的干燥根茎，密封保存于阴凉干燥处。样品来源见表1。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱：Thermo C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：甲醇（A）-0.1%甲酸水溶液（B）；梯度洗脱：10%A（0 min）～48%A（36 min）～80%A（70 min）；流速：1.0 mL/min；检测波长：323 nm；柱温：25 ℃；进样量：10 μL。
2.2 对照品溶液制备
精密称取阿魏酸对照品适量，加甲醇制成每1 mL含阿魏酸328 μg的溶液，即得。
2.3 供试品溶液制备
精密称取川芎粉末2.0 g，置圆底烧瓶中，加入甲醇30 mL，于70 ℃水浴中加热，冷凝回流提取1 h，放冷，过滤，残渣同法再提取1次，过滤，合并2次滤液，水浴挥干，用甲醇溶解并定容至10 mL，14 000 r/min离心5 min，吸取上清液，过0.45 ?m滤膜，即得。
2.4 方法学考察
2.4.1 精密度试验 取“2.2”项下对照品溶液，连续进样6次，每次10 μL，考察阿魏酸色谱峰保留时间和峰面积的一致性，均RSD<3.0%，说明仪器精密度良好，符合指纹图谱的要求。
2.4.2 稳定性试验 取S9供试品溶液，分别在0、4、8、12、16、24 h进样10 ?L，依法测定，以阿魏酸保留时间和峰面积计算，结果均RSD<3.0%。表明川芎样品在室温条件下24 h内稳定性良好。
2.4.3 重复性试验 取S9样品，按“2.3”项下方法平行制备6份供试品溶液，按照“2.1”项下色谱条件进行测定，以阿魏酸保留时间和峰面积计算，结果均RSD<3.0%，表明本方法重复性良好，
2.5 指纹图谱测定
取18批川芎药材，按照“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样，记录60 min色谱图。通过比较18批川芎的色谱图，确定了11个共有峰，其中4号峰为阿魏酸。结果见图1。
2.6 指纹图谱的建立与分析
2.6.1 参比峰的选择 在各批次样品图谱中，4号色谱峰（阿魏酸）分离度较好，峰面积适中，且为各样品共有，故选择4号峰为参照峰。
2.6.2 指纹图谱的建立及相似度评价 将18批川芎样品色谱图导入国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”（2004A版），通过多点校正法对色谱峰进行自动匹配，生成川芎提取物的色谱指纹图谱共有模式（见图2），并在分析检验模式下，以样品S1图谱作为参照图谱，计算相似度（见表2）。结果显示，2号样品的相似度<0.9，其他产地的川芎药材相似度均≥0.9。
2.6.3 聚类分析 应用SPSS20.0统计分析软件中的系统聚类法中的组间连接法，对川芎HPLC指纹图谱共有峰的峰面积进行分析，选取平方欧氏距离作为样品测度。利用此方法对18批川芎进行综合系统聚类分析，聚类分析图反映的是各样品的相似程度，样品间的分类距离值越大则表明各样品差异性越大。当分类距离取11时，18类川芎样品被分为3类：第Ⅰa类为样品S3、S15、S5、S10、S12、S13、S14、S6、S11、S7，第Ⅱa类为样品S9、S17、S18、S8、S16、S2、S1，第Ⅲa类为样品S4。 2.6.4 主成分分析 根据18批川芎样品的HPLC指纹图谱11个共有峰的峰面积，选取峰面积较大的主要共有峰（分别为阿魏酸及5、6、9、10、11未知成分）作为指标，采用SPSS20.0软件对18批川芎样品进行主成分分析。以选取的6个主要成分的峰面积为数据源，所有数据经过标准化处理后，分别求得对应于2个最大特征值的主成分PCA1（阿魏酸）和PCA2（未知9号共有峰），以PCA1和PCA2建立坐标系，进行投影。各样本之间的距离越远相似性越差。18批样品可分为3类：第Ⅰb类为样品S3、S15、S5、S10、S12、S13、S14、S6、S11、S7，第Ⅱb类为样品S9、S17、S18、S8、S16、S2、S1；第Ⅲb类为样品S4。分类结果与聚类分析结果一致。
3 讨论
本试验对提取溶剂甲醇、乙醇、正丁醇、乙酸乙酯、乙醚进行考察，以甲醇提取的样品色谱峰个数较多，峰型较好，峰面积较大，故提取溶剂选择甲醇。对超声和回流两种不同提取方法进行比较，2种提取方法无明显差异，故选择回流提取。同时对提取时间（10、30、60 min）和提取次数（1、2次）及提取溶剂用量（20、30、40 mL）进行考察，最终确定“2.3”项下供试品溶液制备方法。
色谱条件分别考察了甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸水、甲醇-0.2%甲酸水、甲醇-0.3%甲酸水4个流动相系统，结果表明，采用甲醇-0.1%甲酸水系统，各峰的分离度较好，基线平稳，有利于指纹图谱的建立，因此，确定甲醇-0.1%甲酸水作为流动相系统。
对样品进行全波长扫描后发现，323 nm波长下的各色谱峰分离度最佳，且各色谱峰均能完好地体现在色谱图上，故选择323 nm作为检测波长。
由表2知，S2样品中阿魏酸含量与其他批次有显著差异，而其他各样品阿魏酸含量较接近，可见以单一化学对照品作为鉴别标准并不能准确地辨别出药材的质量。而从药材整体色谱图入手，选取特征峰，并大致判断其峰位和比例关系，构成该药材特有的色谱指纹图谱全貌，可以为药材质量的分析与控制提供可靠的依据，较以单一化学对照品作为鉴别标准全面得多。中药指纹图谱技术对增加中药质控科技含量、提高中药工业整体水平具有非常重要的现实意义[9]。
中药成分复杂，液相色谱分析中多采用梯度洗脱的方式，以保证分离的效果和工作的效率。而基线的漂移是梯度洗脱中常见的问题，由此引起的积分困难使中药指纹图谱的数据处理难以进行[10]。本试验采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”，该软件的使用为大量数据的处理提供了便利，并有效保证了处理结果的准确性。
参考文献：
[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京：中国医药科技出版社，2010：68.
[2] 张晓琳，徐金娣，朱玲英，等.中药川芎研究新进展[J].中药材，2012， 35（10）：1706-1710.
[3] 肖培根.新编中药志：第1卷[M].北京：化学工业出版社，2002：121.
[4] 肖永庆，李丽，游小琳，等.川芎化学成分研究[J].中国中药杂志，2002， 27（7）：519.
[5] 国家药品监督管理局.中药注射剂指纹图谱研究的技术要求（暂行）[J].中成药，2000，22（10）：671.
[6] Wei Hua， Sun Lianna， Tai Zongguang， et al. A simple and sensitive HPLC method for the simultaneous determination of eight bioactive components and fingerprint analysis of Schisandra sphenanthera[J]. Anal Chim Acta，2010，662：97-104.
[7] 段坤峰，袁志芳，郑旭光，等.马鞭草HPLC-PDA指纹图谱研究[J].中草药，2009，40（12）：1984-1988.
[8] 刘小丽，石丽，李华.川芎药材HPLC指纹图谱及阿魏酸测定研究[J].中成药，2011，33（8）：1289-1292.
[9] 杨光明，蔡宝昌，潘扬，等.川芎药材指纹图谱研究与产地比较[J].南京中医药大学学报：自然科学版，2002，18（3）：172-173.
[10] 宋金春.川芎RP-HPLC指纹图谱的建立及其质量研究[J].中国药师， 2006，9（4）：297-301.
（收稿日期：2013-09-13，编辑：陈静）
关键词：川芎；指纹图谱；高效液相色谱法
中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2014）04-0086-04
川芎为伞形科植物川芎Ligusticum chuanxiong Hort.的干燥根茎，主要栽培于四川、云南、贵州、广西、湖北等地。川芎始载于《神农本草经》，味辛、微苦、性温，具有活血祛瘀、行气开郁、祛风止痛之功，用于血瘀气滞所致的月经不调、痛经经闭，肝郁气滞而致血行不畅的胸胁疼痛、头痛，风寒湿痹、跌打肿痛等[1-2]。
现代化学和药理研究表明，川芎的活性成分主要包括挥发油类、酚酸类和生物碱类[3-4]，川芎的质量和道地性均与活性成分的含量和种类紧密相关。中药质量评价一直是中药研究与应用中的难点与重点问题，而建立在中药成分系统研究基础上的中药指纹图谱分析是一种综合、有效的评价手段，已成为国际公认的控制中药或天然药物质量最有效的方法之一[5-8]。为了更深入地研究并揭示川芎的质量差异，本试验对18个批次的川芎药材采用高效液相色谱法（HPLC）并结合“中药材指纹图谱相似系统”和SPSS统计软件进行分析，从而评价川芎药材的质量。 1 仪器与试药
美国Waters e2695高效液相色谱系统，包括在线脱气机，自动进样器Prominence SIL-20A，二极管阵列检测器Waters2998和柱温箱CTO-20A；Thermo C18 （250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱；Anke TGL-16C高速离心机（上海安亭科学仪器厂）；电子分析天平（FA1204B，上海精密科学有限公司）；恒温水浴锅（HH-2K6，巩义市予华仪器有限责任公司）。
阿魏酸对照品（批号110773-200611，纯度≥98%，中国药品生物制品检验所），甲醇（色谱纯，江苏汉邦科技有限公司），纯净水（杭州娃哈哈有限公司）。川芎对照药材（批号120927-200604，中国药品生物制品检验所）。川芎药材共18个批次，经南京中医药大学刘圣金老师鉴定为伞形科植物川芎Ligusticum chuanxiong Hort.的干燥根茎，密封保存于阴凉干燥处。样品来源见表1。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱：Thermo C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：甲醇（A）-0.1%甲酸水溶液（B）；梯度洗脱：10%A（0 min）～48%A（36 min）～80%A（70 min）；流速：1.0 mL/min；检测波长：323 nm；柱温：25 ℃；进样量：10 μL。
2.2 对照品溶液制备
精密称取阿魏酸对照品适量，加甲醇制成每1 mL含阿魏酸328 μg的溶液，即得。
2.3 供试品溶液制备
精密称取川芎粉末2.0 g，置圆底烧瓶中，加入甲醇30 mL，于70 ℃水浴中加热，冷凝回流提取1 h，放冷，过滤，残渣同法再提取1次，过滤，合并2次滤液，水浴挥干，用甲醇溶解并定容至10 mL，14 000 r/min离心5 min，吸取上清液，过0.45 ?m滤膜，即得。
2.4 方法学考察
2.4.1 精密度试验 取“2.2”项下对照品溶液，连续进样6次，每次10 μL，考察阿魏酸色谱峰保留时间和峰面积的一致性，均RSD<3.0%，说明仪器精密度良好，符合指纹图谱的要求。
2.4.2 稳定性试验 取S9供试品溶液，分别在0、4、8、12、16、24 h进样10 ?L，依法测定，以阿魏酸保留时间和峰面积计算，结果均RSD<3.0%。表明川芎样品在室温条件下24 h内稳定性良好。
2.4.3 重复性试验 取S9样品，按“2.3”项下方法平行制备6份供试品溶液，按照“2.1”项下色谱条件进行测定，以阿魏酸保留时间和峰面积计算，结果均RSD<3.0%，表明本方法重复性良好，
2.5 指纹图谱测定
取18批川芎药材，按照“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样，记录60 min色谱图。通过比较18批川芎的色谱图，确定了11个共有峰，其中4号峰为阿魏酸。结果见图1。
2.6 指纹图谱的建立与分析
2.6.1 参比峰的选择 在各批次样品图谱中，4号色谱峰（阿魏酸）分离度较好，峰面积适中，且为各样品共有，故选择4号峰为参照峰。
2.6.2 指纹图谱的建立及相似度评价 将18批川芎样品色谱图导入国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”（2004A版），通过多点校正法对色谱峰进行自动匹配，生成川芎提取物的色谱指纹图谱共有模式（见图2），并在分析检验模式下，以样品S1图谱作为参照图谱，计算相似度（见表2）。结果显示，2号样品的相似度<0.9，其他产地的川芎药材相似度均≥0.9。
2.6.3 聚类分析 应用SPSS20.0统计分析软件中的系统聚类法中的组间连接法，对川芎HPLC指纹图谱共有峰的峰面积进行分析，选取平方欧氏距离作为样品测度。利用此方法对18批川芎进行综合系统聚类分析，聚类分析图反映的是各样品的相似程度，样品间的分类距离值越大则表明各样品差异性越大。当分类距离取11时，18类川芎样品被分为3类：第Ⅰa类为样品S3、S15、S5、S10、S12、S13、S14、S6、S11、S7，第Ⅱa类为样品S9、S17、S18、S8、S16、S2、S1，第Ⅲa类为样品S4。 2.6.4 主成分分析 根据18批川芎样品的HPLC指纹图谱11个共有峰的峰面积，选取峰面积较大的主要共有峰（分别为阿魏酸及5、6、9、10、11未知成分）作为指标，采用SPSS20.0软件对18批川芎样品进行主成分分析。以选取的6个主要成分的峰面积为数据源，所有数据经过标准化处理后，分别求得对应于2个最大特征值的主成分PCA1（阿魏酸）和PCA2（未知9号共有峰），以PCA1和PCA2建立坐标系，进行投影。各样本之间的距离越远相似性越差。18批样品可分为3类：第Ⅰb类为样品S3、S15、S5、S10、S12、S13、S14、S6、S11、S7，第Ⅱb类为样品S9、S17、S18、S8、S16、S2、S1；第Ⅲb类为样品S4。分类结果与聚类分析结果一致。
3 讨论
本试验对提取溶剂甲醇、乙醇、正丁醇、乙酸乙酯、乙醚进行考察，以甲醇提取的样品色谱峰个数较多，峰型较好，峰面积较大，故提取溶剂选择甲醇。对超声和回流两种不同提取方法进行比较，2种提取方法无明显差异，故选择回流提取。同时对提取时间（10、30、60 min）和提取次数（1、2次）及提取溶剂用量（20、30、40 mL）进行考察，最终确定“2.3”项下供试品溶液制备方法。
色谱条件分别考察了甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸水、甲醇-0.2%甲酸水、甲醇-0.3%甲酸水4个流动相系统，结果表明，采用甲醇-0.1%甲酸水系统，各峰的分离度较好，基线平稳，有利于指纹图谱的建立，因此，确定甲醇-0.1%甲酸水作为流动相系统。
对样品进行全波长扫描后发现，323 nm波长下的各色谱峰分离度最佳，且各色谱峰均能完好地体现在色谱图上，故选择323 nm作为检测波长。
由表2知，S2样品中阿魏酸含量与其他批次有显著差异，而其他各样品阿魏酸含量较接近，可见以单一化学对照品作为鉴别标准并不能准确地辨别出药材的质量。而从药材整体色谱图入手，选取特征峰，并大致判断其峰位和比例关系，构成该药材特有的色谱指纹图谱全貌，可以为药材质量的分析与控制提供可靠的依据，较以单一化学对照品作为鉴别标准全面得多。中药指纹图谱技术对增加中药质控科技含量、提高中药工业整体水平具有非常重要的现实意义[9]。
中药成分复杂，液相色谱分析中多采用梯度洗脱的方式，以保证分离的效果和工作的效率。而基线的漂移是梯度洗脱中常见的问题，由此引起的积分困难使中药指纹图谱的数据处理难以进行[10]。本试验采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”，该软件的使用为大量数据的处理提供了便利，并有效保证了处理结果的准确性。
参考文献：
[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京：中国医药科技出版社，2010：68.
[2] 张晓琳，徐金娣，朱玲英，等.中药川芎研究新进展[J].中药材，2012， 35（10）：1706-1710.
[3] 肖培根.新编中药志：第1卷[M].北京：化学工业出版社，2002：121.
[4] 肖永庆，李丽，游小琳，等.川芎化学成分研究[J].中国中药杂志，2002， 27（7）：519.
[5] 国家药品监督管理局.中药注射剂指纹图谱研究的技术要求（暂行）[J].中成药，2000，22（10）：671.
[6] Wei Hua， Sun Lianna， Tai Zongguang， et al. A simple and sensitive HPLC method for the simultaneous determination of eight bioactive components and fingerprint analysis of Schisandra sphenanthera[J]. Anal Chim Acta，2010，662：97-104.
[7] 段坤峰，袁志芳，郑旭光，等.马鞭草HPLC-PDA指纹图谱研究[J].中草药，2009，40（12）：1984-1988.
[8] 刘小丽，石丽，李华.川芎药材HPLC指纹图谱及阿魏酸测定研究[J].中成药，2011，33（8）：1289-1292.
[9] 杨光明，蔡宝昌，潘扬，等.川芎药材指纹图谱研究与产地比较[J].南京中医药大学学报：自然科学版，2002，18（3）：172-173.
[10] 宋金春.川芎RP-HPLC指纹图谱的建立及其质量研究[J].中国药师， 2006，9（4）：297-301.
（收稿日期：2013-09-13，编辑：陈静）