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摘 要：本研究参照美国国家环境保护局（EPA）关于消毒剂在干燥的非生物体表面的抗病毒效果测评方法，评定美国陶氏化学公司的格利特消毒剂GLUTEX GS2对猪传染性胃肠炎病毒的杀毒效力。结果表明：经合成硬水1：256倍稀释的格利特消毒剂GLUTEX GS2，在与经过干燥处理的猪传染性胃肠炎病毒膜充分接触10 min后，病毒活性低于0.5个滴度，表明此消毒剂对猪传染性胃肠炎病毒具有杀灭效力，可用于此病毒的日常消毒中。
关键词：猪传染性胃肠炎病毒；抗病毒效果；评测；GLUTEX GS2消毒剂
1 实验目的
本测试旨在测评陶氏化学公司格利特消毒剂GLUTEX GS2的抗病毒效力。其方法是用稀释的消毒剂产品液处理被病毒附着污染的物体表面后，测定回收病毒的侵染性，根据病毒侵染性的降低程度来表征消毒剂的抗病毒能力。
2 实验材料和方法
2.1 测试病毒
试验所用猪传染性胃肠炎病毒（ATCC VR-763）来自位于美国马里兰州罗克维尔的美国标准菌库（American Type Culture Collection，ATCC）。该病毒悬浮液是组织培养基。
2.2 细胞组织培养液和培养基
猪睾丸细胞来自位于艾奥瓦州Ames市的国家兽医服务局实验室。培养物利用添加了10 %（V/V）牛胎儿血清（加热到56 ℃，经30 min灭活）、0.5 mg/mL水解乳蛋白、142.5 单位/mL青霉素、142.5 μg/mL链霉素、54 μg/mL泰乐菌素、0.125 μg/mL两性毒素B和25 mM四羟乙基哌嗪乙磺酸的最低必需养分培养基（Minimal Essential Medium，MEM）进行常规培养。经培养后置于37 ℃含 5 % CO2的潮湿空气下的一次性实验室器皿中，制成单层组织培养物。培养物感染病毒后，置于装有相同成分但添加了2 %血清的维持培养基中。
2.3 试剂
磷酸盐缓冲液（PBS缓冲液）采用Dulbecco和Vogt的方法配制（实验医学杂志[J]. 1954， Vol.99：167-182）。合成硬水在使用当天配制，配制方法参照AOAC 4.024法（美国[美国公职分析化学工作者协会（AOAC），第14版，1984，第70～71页）。
2.4 消毒剂的制备
每份消毒剂在使用当天按照1∶256的比例用 1 236 mg/kg AOAC合成硬水进行稀释。
2.5 病毒膜的制备
病毒膜通过将0.2 mL的病毒悬浮液涂复在灭菌的皮氏玻璃培养皿底部制作而成。随后置于室温（约23 ℃）及环境湿度下，避免直接光照直至明显干燥（约45～75 min）。
2.6 用消毒剂处理病毒薄膜
干燥的病毒薄膜在约23 ℃下用2.0 mL消毒剂稀释液（喷雾）处理，使两者保持10 min的充分接触。在规定时间的接触后，用橡胶淀帚刮下培养皿底部物质，并立即取一小份病毒-消毒剂混合物加入交联葡聚糖（Sephadex）凝胶过滤柱中，用凝胶过滤法将病毒从消毒剂中分离出。
2.7 病毒对照薄膜的处理
用消毒剂处理一份病毒薄膜的同时，另一份相同的病毒薄膜再次悬浮在2 mL的磷酸盐缓冲生理盐水中，随后取一小份混合液加入交联葡聚糖凝胶（Sephadex）过滤柱中。
2.8 交联葡聚糖凝胶过滤（Sephadex Gel Filtration）
交联葡聚糖凝胶过滤按照Blackwell和Chen的改良方法[美国公职分析化学工作者协会杂志53期（1970年）第1229～1236页]进行操作。3 cc交联葡聚糖柱（LH-60-120）利用磷酸盐缓冲生理盐水保持平衡，离心清除液体中的空隙体积，随后装入约0.6 mL病毒-消毒剂混合液或病毒-磷酸盐缓冲对照混合液，并再次离心。给过滤液贴上“未稀释”标签以便滴定。
2.9 病毒回收分析
对每份病毒-消毒剂和对照病毒混合液进行稀释，随后接种至细胞培养液中。每份稀释液至少使用4份培养液。单层细胞接种0.05 mL稀释液，并在37 ℃下培养1 h。吸收后，加入维持培养基（0.2 mL），并在恒温37 ℃下接种培养液。接种4 d后，记录培养液细胞病变效应。细胞病变效应最终结果见表1。
2.10细胞毒性对照
每份已稀释的消毒剂通过交联葡聚糖凝胶过滤，利用磷酸盐缓冲液进行倍比稀释，随后接种于添加病毒-消毒剂混合液的细胞培养液中。接种后4 d后，记录细胞培养液的细胞毒性。
2.11 计算方法
采用Reed-Muench法（L. J. Reed和H. Muench. 美国卫生医学杂志[J].1938，Vol.27：493-497），计算以50 %侵染性的log10（TCID50）和毒性（TD50），以表示病毒效价及细胞毒性。
3 实验结果
格利特消毒剂GLUTEX GS2对猪传染性胃肠炎病毒的病毒感染性和细胞毒性测定结果见表1。
4 实验结论
陶氏化学公司格利特消毒剂GLUTEX GS2在测试条件下，能有效杀灭猪传染性胃肠炎病毒。□□
关键词：猪传染性胃肠炎病毒；抗病毒效果；评测；GLUTEX GS2消毒剂
1 实验目的
本测试旨在测评陶氏化学公司格利特消毒剂GLUTEX GS2的抗病毒效力。其方法是用稀释的消毒剂产品液处理被病毒附着污染的物体表面后，测定回收病毒的侵染性，根据病毒侵染性的降低程度来表征消毒剂的抗病毒能力。
2 实验材料和方法
2.1 测试病毒
试验所用猪传染性胃肠炎病毒（ATCC VR-763）来自位于美国马里兰州罗克维尔的美国标准菌库（American Type Culture Collection，ATCC）。该病毒悬浮液是组织培养基。
2.2 细胞组织培养液和培养基
猪睾丸细胞来自位于艾奥瓦州Ames市的国家兽医服务局实验室。培养物利用添加了10 %（V/V）牛胎儿血清（加热到56 ℃，经30 min灭活）、0.5 mg/mL水解乳蛋白、142.5 单位/mL青霉素、142.5 μg/mL链霉素、54 μg/mL泰乐菌素、0.125 μg/mL两性毒素B和25 mM四羟乙基哌嗪乙磺酸的最低必需养分培养基（Minimal Essential Medium，MEM）进行常规培养。经培养后置于37 ℃含 5 % CO2的潮湿空气下的一次性实验室器皿中，制成单层组织培养物。培养物感染病毒后，置于装有相同成分但添加了2 %血清的维持培养基中。
2.3 试剂
磷酸盐缓冲液（PBS缓冲液）采用Dulbecco和Vogt的方法配制（实验医学杂志[J]. 1954， Vol.99：167-182）。合成硬水在使用当天配制，配制方法参照AOAC 4.024法（美国[美国公职分析化学工作者协会（AOAC），第14版，1984，第70～71页）。
2.4 消毒剂的制备
每份消毒剂在使用当天按照1∶256的比例用 1 236 mg/kg AOAC合成硬水进行稀释。
2.5 病毒膜的制备
病毒膜通过将0.2 mL的病毒悬浮液涂复在灭菌的皮氏玻璃培养皿底部制作而成。随后置于室温（约23 ℃）及环境湿度下，避免直接光照直至明显干燥（约45～75 min）。
2.6 用消毒剂处理病毒薄膜
干燥的病毒薄膜在约23 ℃下用2.0 mL消毒剂稀释液（喷雾）处理，使两者保持10 min的充分接触。在规定时间的接触后，用橡胶淀帚刮下培养皿底部物质，并立即取一小份病毒-消毒剂混合物加入交联葡聚糖（Sephadex）凝胶过滤柱中，用凝胶过滤法将病毒从消毒剂中分离出。
2.7 病毒对照薄膜的处理
用消毒剂处理一份病毒薄膜的同时，另一份相同的病毒薄膜再次悬浮在2 mL的磷酸盐缓冲生理盐水中，随后取一小份混合液加入交联葡聚糖凝胶（Sephadex）过滤柱中。
2.8 交联葡聚糖凝胶过滤（Sephadex Gel Filtration）
交联葡聚糖凝胶过滤按照Blackwell和Chen的改良方法[美国公职分析化学工作者协会杂志53期（1970年）第1229～1236页]进行操作。3 cc交联葡聚糖柱（LH-60-120）利用磷酸盐缓冲生理盐水保持平衡，离心清除液体中的空隙体积，随后装入约0.6 mL病毒-消毒剂混合液或病毒-磷酸盐缓冲对照混合液，并再次离心。给过滤液贴上“未稀释”标签以便滴定。
2.9 病毒回收分析
对每份病毒-消毒剂和对照病毒混合液进行稀释，随后接种至细胞培养液中。每份稀释液至少使用4份培养液。单层细胞接种0.05 mL稀释液，并在37 ℃下培养1 h。吸收后，加入维持培养基（0.2 mL），并在恒温37 ℃下接种培养液。接种4 d后，记录培养液细胞病变效应。细胞病变效应最终结果见表1。
2.10细胞毒性对照
每份已稀释的消毒剂通过交联葡聚糖凝胶过滤，利用磷酸盐缓冲液进行倍比稀释，随后接种于添加病毒-消毒剂混合液的细胞培养液中。接种后4 d后，记录细胞培养液的细胞毒性。
2.11 计算方法
采用Reed-Muench法（L. J. Reed和H. Muench. 美国卫生医学杂志[J].1938，Vol.27：493-497），计算以50 %侵染性的log10（TCID50）和毒性（TD50），以表示病毒效价及细胞毒性。
3 实验结果
格利特消毒剂GLUTEX GS2对猪传染性胃肠炎病毒的病毒感染性和细胞毒性测定结果见表1。
4 实验结论
陶氏化学公司格利特消毒剂GLUTEX GS2在测试条件下，能有效杀灭猪传染性胃肠炎病毒。□□