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[摘要] 目的 探讨γ干扰素（IFN-γ）诱导大鼠脾脏树突状细胞（DC）的吲哚胺2，3-双加氧酶（IDO）的表达情况。方法 大鼠脾脏分离培养DC，进行形态特征观察，流式细胞术检测DC的表型及确定其纯度。分别用不同浓度的IFN-γ诱导作用DC后，荧光定量RT-PCR测定IDO mRNA的相对表达水平。结果 大鼠脾脏分离培养的DC纯度可达80%以上，培养10d的DC具有典型的树枝状突起，CD80、CD86的阳性表达分别达75%、90%以上。IDO mRNA的表达水平随IFN-γ的浓度的增大逐渐增加。结论 IFN-γ在体外能诱导大鼠脾脏DC的IDO表达。
[关键词] 树突状细胞；吲哚胺-2，3-双加氧酶；γ干扰素
[中图分类号] R322.1 [文獻标识码] A [文章编号] 1673-9701（2009）12-48-03
Study of γ-interferon-induced Expression of Indoleamine 2，3-Dioxygenase of Rat Spleen-derived Dendritic Cells in Vitro
ZHANG Jing1XU Jun2
1.Shanxi Medicine University；2. General Surgery of Shanxi Province People's Hospital，Taiyuan 030012
[Abstract] Objective To study the effect of γ-interferon（IFN-γ） on the indoleamine 2，3-dioxygenase（IDO） expression in rat spleen-derived dendritic cells（DC）. Methods DC were isolated and cultured from spleen in rat. The morphology of DC observed by microphotograph. The purity and phenotype were analyzed with flow cytometry. Separately with different concentrations of IFN-γ induced DC，relative expression of IDO mRNA were detectec by fluorescence quantitative RT-PCR. Results The purity of cultured DCs above 80%.DCs cultured at 10 days with typical dendritic morphogy. The positive expression of CD80 and CD86 were more than 75% and 90%.Expressions of IDO mRNA with the concentration of IFN-γ increased gradually increase. Conclusion IFN-γ could induce the expression of IDO of rat spleen-derived DC in vitro.
[Key Words] Dendritic cells； Indoleamine 2，3-dioxygenase； γ-interferon
树突状细胞（DC）是机体内功能最强的抗原提呈细胞，不仅参与对外来抗原的免疫反应，而且在诱导免疫耐受中也起着重要的作用。DC可通过多种机制诱导免疫耐受。最近有研究表明，DC还可能通过产生吲哚胺-2，3-双加氧酶（IDO）来降低T淋巴细胞活性、抑制T淋巴细胞增殖[1-2]，诱导免疫耐受。因此，上调DC细胞的IDO表达可能为诱导移植后免疫耐受的新策略。本研究观察在γ干扰素（IFN-γ）作用下DC的IDO表达情况，为今后IDO应用于防止移植免疫排斥反应提供一定的实验基础。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1主要试剂RPMI1640培养液、胎牛血清购自美国Hyclone公司，重组大鼠粒细胞集落刺激因子（rmGM-CSF）、重组大鼠白细胞介素4（rmIL-4）、重组大鼠干扰素γ（IFN-γ）购自美国Pepro Tech公司，脂多糖（LPS）购自美国Sigma公司，PE标记的抗大鼠OX62购自英国AbD serotec公司，PE标记的抗大鼠CD80、FITC标记的抗大鼠CD86购自美国eBioscience公司。反转录试剂盒购自Fermentas公司，IDO与β-actin引物和TaqMan探针由上海基康生物技术有限公司设计。
1.1.2动物来源Wister大鼠由山西医科大学实验动物中心提供，8~10周，体重200~250g。
1.2方法
1.2.1脾脏DC的分离与培养颈椎脱臼法处死大鼠，75%酒精浸泡，无菌取出脾脏，放入盛RPMI 1640 10mL的10cm培养皿中；将脾脏剪碎成1~2mm3的组织块，碾磨过200目滤膜，将细胞悬液收集于15mL离心管中，1000r/min离心10min，弃上清；细胞沉淀中加入3mL PBS液，用吸管轻轻吹打混匀，加入3倍体积的红细胞裂解液，冰上放置15min，期间轻轻涡旋混匀两次，450×g离心10min，弃上清；向细胞沉淀加入2倍细胞压积的红细胞裂解液，充分重悬细胞，45×g离心10min，弃上清；PRMI 1640培养液重悬细胞；取15mL离心管，将Ficoll-Hypaque淋巴细胞分离液置于离心管底部，细胞悬液于细胞分离液液面上，比例为2∶1；2500r/min，离心25min；用吸管吸取中间白雾层置于另一干净离心管，用D-Hank's漂洗液洗涤1次；PRMI 1640完全培养液调整细胞浓度为2×106/mL，接种于12孔培养板，每孔2mL。37℃、5%CO2孵箱培养2h；全量换液，用预热的PRMI 1640完全培养液冲洗，充分去掉悬浮细胞；加入PRMI 1640完全培养液，添加细胞因子GM-CSF（30ng/mL）、IL-4（40ng/mL）；37℃、5%CO2条件下培养，隔天半量换液一次，添加细胞因子；第8天加入LPS 1μg/mL，继续培养48h后收集半贴壁细胞。
1.2.2DC的形态学观察在培养的过程中，每天倒置显微镜下观察细胞的生长情况、形态，集落的数量和大小，以及培养基是否受污染，并拍片。
1.2.3细胞表型分析收集培养10d的DC，PBS缓冲液洗涤2次，调整细胞数为（1~2）×106/mL。每管加细胞悬液200μL，分别加入PE标记的抗大鼠CD80 2.5μL和FITC标记的抗大鼠CD86 1μL，或者PE标记的抗大鼠OX-62 10μL；避光，放置30min，4000r/min，离心5min，弃上清；PBS缓冲液洗涤细胞2次，每管加生理盐水500μL重悬细胞，流式细胞仪进行细胞表型分析。
1.2.4不同浓度IFN-γ对DC的作用细胞培养第9天分成四组，分别以0、100、300、500U/mL的浓度加入IFN-γ，继续培养18h后，收集半贴壁细胞用于IDO mRNA的检测。
1.2.5荧光定量PCR测定IDO mRNATrizol试剂提取不同浓度IFN-γ作用后的DC总RNA，根据Fermentas RT-PCR试剂盒说明书反转录合成cDNA第一链。大鼠IDO扩增片段上游引物为5’-TGAAGATGTGGGCTTTGCTCTA-3’，下游引物为5’-GGCAGATTTCTAGCCACAAGGA-3’，TaqMan探针序列为（FAM）ACATCCACTGGAGGAGCTGCCTGATACG。采用β-actin作为内参，反应体系为25μl，在StepOne TM实时荧光定量PCR仪上进行相对定量PCR反应。扩增条件为94℃ 2min；94℃ 20s，60℃ 40s，循环次数为40次。
1.3统计学处理
采用单因素方差分析（ANOVA）方法，各组测得值以均数±标准差（χ±s）表示，P＜0.05为有显著性差异。
2结果
2.1DC的形态学观察
新分离的DC呈圆形，胞体小；培养第3天胞体圆，无突起；培养第7天出现毛刺状细胞，毛刺短，细胞呈集落生长（图1）；培养第10天加LPS刺激后，树突状突起明显，出现典型的DC形态（图2）。
2.2细胞表型分析
流式细胞仪分析结果显示，80%以上培养10d的DC表达大鼠DC特异性表达分子OX-62（图3）；DC表面共刺激分子CD80和CD86的表达分别为75%和90%以上（图4）。
2.3IFN-γ作用下DC的IDO mRNA表达
StepOne软件分析结果示，IFN-γ浓度为0U/mL的DC作为对照，IDO mRNA相对值的均数为1，其他三组的mRNA相对值的均数分别为1.4624、1.4264和2.090。随着IFN-γ的浓度增大，IDO mRNA的表达水平随逐渐增加（图5）。IFN-γ浓度为500U/mL组，IDO mRNA的表达水平明显高于其他两组（P＜0.05）。
3 讨论
随着外科技术的日臻完善，器官移植已广泛开展，但如何控制移植后的免疫排斥反应，诱导宿主对移植物产生免疫耐受，延长移植物的存活时间一直是人们所期待解决的问题。DC是目前发现的最重要的参与免疫耐受的抗原提呈细胞。吲哚胺-2，3-双加氧酶（IDO）是细胞内一种亚铁血红素的酶，是肝脏以外惟一可催化色氨酸沿犬尿酸途径分解代谢的限速酶。
研究发现，IDO至少通过两种机制引起免疫耐受：①T细胞增殖中的G1期中期对色氨酸非常敏感，IDO过度表达使色氨酸缺乏，T细胞不能有效的增殖和激活[4]；②通过诱导Treg细胞的增殖，产生大量IL-10和TGF-β来抑制T细胞的免疫功能[5]。
IFN-γ主要分布于细胞表面的高亲合力的受体IFN-γR（IFN-γ-receptor，IFN GR）来发挥生物学效应的，INF-γ通过与受体结合后使信号转导转录激活因子1（STA T1）与IDO 启动子的活化序列GAS-2和GAS-3 结合，诱导IDO 的表达。也可通过刺激细胞合成IRF-1，IRF-1 结合于IDO基因上游的ISRE-1 和ISRE-2 從而诱导IDO 的表达[6-8]。本研究从大鼠脾脏提取DC，经红细胞裂解、淋巴细胞分离及手法筛选，经流式细胞仪鉴定纯度高；通过观察IFN-γ作用下DC的IDO表达情况，结果发现IFN-γ可以明显上调IDO mRNA的表达，且其表达水平与IFN-γ呈剂量依赖性，IFN-γ500U/mL组的IDO mRNA的表达水平为对照组的2倍，这为IDO运用于诱导抑制免疫耐受提供了实验基础。
[参考文献]
[1] Munn DH，Sharma MD，Lee JR，et al. potential regulatory function of human dendritic cells expressing indoleamine 2，3-dioxygenase[J]. Science，2002，297（5588）：1867-1870.
[2] Davis PM，Nadler SG，Stetsko DK&Suchard SJ. Abatacept modulates human dendritic cell-stimulated T-cell proliferation and effector function independent of IDO induction[J]. Clin Immunol，2008，126（1）：38-47.
[3] Zhang M，Wang Q，Liu Y，et al. Effective induction of immune tolerance by portal venous infusion with IL-10 gene-modified immature dendritic cells leading to prolongation of allograft survival[J]. J Mol Med，2004，82（4）：240-249.
[4] Bauer TM，Jiga LP，Chuang JJ，et al. Studying the immunosuppressive role of indoleamine 2，3-dioxygenase： tryptophan metabolites suppress rat allogeneic T-cell responses in vitro and in vivo[J]. Transpl Int，2005，18 （1）：95-100.
[5] Bluestone JA. Regulatory T-cell therapy： is it ready for the clinic[J]. Nat Rev Immunol，2003，5（4）：343-349.
[6] Tsukahara T，Kim S，Taylor MW. A search framework for the identification of interferon-responsive elements in DNA sequences-a case study with ISRE and GAS[J]. Comput Biol Chem，2006，30 （2）：134-147.
[7] Chon SY，Hassanain HH，Gupta SL. Cooperative role of interferon regulatory factor 1 and p91 （STAT1） response elements in interferon-γ-inducible expression of human indoleamine 2，3-dioxygenase gene[J]. J Biol Chem，1996，271（29）：17247-17252.
[8] Robinson CM，Hale PT，Carlin JM. The role of IFN-γ and TNF-α-responsive regulatory elements in the synergistic induction of indoleamine dioxygenase[J]. J Interferon Cytokine Res，2005，25（1）：20-30.
（收稿日期：2009-03-02）
[关键词] 树突状细胞；吲哚胺-2，3-双加氧酶；γ干扰素
[中图分类号] R322.1 [文獻标识码] A [文章编号] 1673-9701（2009）12-48-03
Study of γ-interferon-induced Expression of Indoleamine 2，3-Dioxygenase of Rat Spleen-derived Dendritic Cells in Vitro
ZHANG Jing1XU Jun2
1.Shanxi Medicine University；2. General Surgery of Shanxi Province People's Hospital，Taiyuan 030012
[Abstract] Objective To study the effect of γ-interferon（IFN-γ） on the indoleamine 2，3-dioxygenase（IDO） expression in rat spleen-derived dendritic cells（DC）. Methods DC were isolated and cultured from spleen in rat. The morphology of DC observed by microphotograph. The purity and phenotype were analyzed with flow cytometry. Separately with different concentrations of IFN-γ induced DC，relative expression of IDO mRNA were detectec by fluorescence quantitative RT-PCR. Results The purity of cultured DCs above 80%.DCs cultured at 10 days with typical dendritic morphogy. The positive expression of CD80 and CD86 were more than 75% and 90%.Expressions of IDO mRNA with the concentration of IFN-γ increased gradually increase. Conclusion IFN-γ could induce the expression of IDO of rat spleen-derived DC in vitro.
[Key Words] Dendritic cells； Indoleamine 2，3-dioxygenase； γ-interferon
树突状细胞（DC）是机体内功能最强的抗原提呈细胞，不仅参与对外来抗原的免疫反应，而且在诱导免疫耐受中也起着重要的作用。DC可通过多种机制诱导免疫耐受。最近有研究表明，DC还可能通过产生吲哚胺-2，3-双加氧酶（IDO）来降低T淋巴细胞活性、抑制T淋巴细胞增殖[1-2]，诱导免疫耐受。因此，上调DC细胞的IDO表达可能为诱导移植后免疫耐受的新策略。本研究观察在γ干扰素（IFN-γ）作用下DC的IDO表达情况，为今后IDO应用于防止移植免疫排斥反应提供一定的实验基础。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1主要试剂RPMI1640培养液、胎牛血清购自美国Hyclone公司，重组大鼠粒细胞集落刺激因子（rmGM-CSF）、重组大鼠白细胞介素4（rmIL-4）、重组大鼠干扰素γ（IFN-γ）购自美国Pepro Tech公司，脂多糖（LPS）购自美国Sigma公司，PE标记的抗大鼠OX62购自英国AbD serotec公司，PE标记的抗大鼠CD80、FITC标记的抗大鼠CD86购自美国eBioscience公司。反转录试剂盒购自Fermentas公司，IDO与β-actin引物和TaqMan探针由上海基康生物技术有限公司设计。
1.1.2动物来源Wister大鼠由山西医科大学实验动物中心提供，8~10周，体重200~250g。
1.2方法
1.2.1脾脏DC的分离与培养颈椎脱臼法处死大鼠，75%酒精浸泡，无菌取出脾脏，放入盛RPMI 1640 10mL的10cm培养皿中；将脾脏剪碎成1~2mm3的组织块，碾磨过200目滤膜，将细胞悬液收集于15mL离心管中，1000r/min离心10min，弃上清；细胞沉淀中加入3mL PBS液，用吸管轻轻吹打混匀，加入3倍体积的红细胞裂解液，冰上放置15min，期间轻轻涡旋混匀两次，450×g离心10min，弃上清；向细胞沉淀加入2倍细胞压积的红细胞裂解液，充分重悬细胞，45×g离心10min，弃上清；PRMI 1640培养液重悬细胞；取15mL离心管，将Ficoll-Hypaque淋巴细胞分离液置于离心管底部，细胞悬液于细胞分离液液面上，比例为2∶1；2500r/min，离心25min；用吸管吸取中间白雾层置于另一干净离心管，用D-Hank's漂洗液洗涤1次；PRMI 1640完全培养液调整细胞浓度为2×106/mL，接种于12孔培养板，每孔2mL。37℃、5%CO2孵箱培养2h；全量换液，用预热的PRMI 1640完全培养液冲洗，充分去掉悬浮细胞；加入PRMI 1640完全培养液，添加细胞因子GM-CSF（30ng/mL）、IL-4（40ng/mL）；37℃、5%CO2条件下培养，隔天半量换液一次，添加细胞因子；第8天加入LPS 1μg/mL，继续培养48h后收集半贴壁细胞。
1.2.2DC的形态学观察在培养的过程中，每天倒置显微镜下观察细胞的生长情况、形态，集落的数量和大小，以及培养基是否受污染，并拍片。
1.2.3细胞表型分析收集培养10d的DC，PBS缓冲液洗涤2次，调整细胞数为（1~2）×106/mL。每管加细胞悬液200μL，分别加入PE标记的抗大鼠CD80 2.5μL和FITC标记的抗大鼠CD86 1μL，或者PE标记的抗大鼠OX-62 10μL；避光，放置30min，4000r/min，离心5min，弃上清；PBS缓冲液洗涤细胞2次，每管加生理盐水500μL重悬细胞，流式细胞仪进行细胞表型分析。
1.2.4不同浓度IFN-γ对DC的作用细胞培养第9天分成四组，分别以0、100、300、500U/mL的浓度加入IFN-γ，继续培养18h后，收集半贴壁细胞用于IDO mRNA的检测。
1.2.5荧光定量PCR测定IDO mRNATrizol试剂提取不同浓度IFN-γ作用后的DC总RNA，根据Fermentas RT-PCR试剂盒说明书反转录合成cDNA第一链。大鼠IDO扩增片段上游引物为5’-TGAAGATGTGGGCTTTGCTCTA-3’，下游引物为5’-GGCAGATTTCTAGCCACAAGGA-3’，TaqMan探针序列为（FAM）ACATCCACTGGAGGAGCTGCCTGATACG。采用β-actin作为内参，反应体系为25μl，在StepOne TM实时荧光定量PCR仪上进行相对定量PCR反应。扩增条件为94℃ 2min；94℃ 20s，60℃ 40s，循环次数为40次。
1.3统计学处理
采用单因素方差分析（ANOVA）方法，各组测得值以均数±标准差（χ±s）表示，P＜0.05为有显著性差异。
2结果
2.1DC的形态学观察
新分离的DC呈圆形，胞体小；培养第3天胞体圆，无突起；培养第7天出现毛刺状细胞，毛刺短，细胞呈集落生长（图1）；培养第10天加LPS刺激后，树突状突起明显，出现典型的DC形态（图2）。
2.2细胞表型分析
流式细胞仪分析结果显示，80%以上培养10d的DC表达大鼠DC特异性表达分子OX-62（图3）；DC表面共刺激分子CD80和CD86的表达分别为75%和90%以上（图4）。
2.3IFN-γ作用下DC的IDO mRNA表达
StepOne软件分析结果示，IFN-γ浓度为0U/mL的DC作为对照，IDO mRNA相对值的均数为1，其他三组的mRNA相对值的均数分别为1.4624、1.4264和2.090。随着IFN-γ的浓度增大，IDO mRNA的表达水平随逐渐增加（图5）。IFN-γ浓度为500U/mL组，IDO mRNA的表达水平明显高于其他两组（P＜0.05）。
3 讨论
随着外科技术的日臻完善，器官移植已广泛开展，但如何控制移植后的免疫排斥反应，诱导宿主对移植物产生免疫耐受，延长移植物的存活时间一直是人们所期待解决的问题。DC是目前发现的最重要的参与免疫耐受的抗原提呈细胞。吲哚胺-2，3-双加氧酶（IDO）是细胞内一种亚铁血红素的酶，是肝脏以外惟一可催化色氨酸沿犬尿酸途径分解代谢的限速酶。
研究发现，IDO至少通过两种机制引起免疫耐受：①T细胞增殖中的G1期中期对色氨酸非常敏感，IDO过度表达使色氨酸缺乏，T细胞不能有效的增殖和激活[4]；②通过诱导Treg细胞的增殖，产生大量IL-10和TGF-β来抑制T细胞的免疫功能[5]。
IFN-γ主要分布于细胞表面的高亲合力的受体IFN-γR（IFN-γ-receptor，IFN GR）来发挥生物学效应的，INF-γ通过与受体结合后使信号转导转录激活因子1（STA T1）与IDO 启动子的活化序列GAS-2和GAS-3 结合，诱导IDO 的表达。也可通过刺激细胞合成IRF-1，IRF-1 结合于IDO基因上游的ISRE-1 和ISRE-2 從而诱导IDO 的表达[6-8]。本研究从大鼠脾脏提取DC，经红细胞裂解、淋巴细胞分离及手法筛选，经流式细胞仪鉴定纯度高；通过观察IFN-γ作用下DC的IDO表达情况，结果发现IFN-γ可以明显上调IDO mRNA的表达，且其表达水平与IFN-γ呈剂量依赖性，IFN-γ500U/mL组的IDO mRNA的表达水平为对照组的2倍，这为IDO运用于诱导抑制免疫耐受提供了实验基础。
[参考文献]
[1] Munn DH，Sharma MD，Lee JR，et al. potential regulatory function of human dendritic cells expressing indoleamine 2，3-dioxygenase[J]. Science，2002，297（5588）：1867-1870.
[2] Davis PM，Nadler SG，Stetsko DK&Suchard SJ. Abatacept modulates human dendritic cell-stimulated T-cell proliferation and effector function independent of IDO induction[J]. Clin Immunol，2008，126（1）：38-47.
[3] Zhang M，Wang Q，Liu Y，et al. Effective induction of immune tolerance by portal venous infusion with IL-10 gene-modified immature dendritic cells leading to prolongation of allograft survival[J]. J Mol Med，2004，82（4）：240-249.
[4] Bauer TM，Jiga LP，Chuang JJ，et al. Studying the immunosuppressive role of indoleamine 2，3-dioxygenase： tryptophan metabolites suppress rat allogeneic T-cell responses in vitro and in vivo[J]. Transpl Int，2005，18 （1）：95-100.
[5] Bluestone JA. Regulatory T-cell therapy： is it ready for the clinic[J]. Nat Rev Immunol，2003，5（4）：343-349.
[6] Tsukahara T，Kim S，Taylor MW. A search framework for the identification of interferon-responsive elements in DNA sequences-a case study with ISRE and GAS[J]. Comput Biol Chem，2006，30 （2）：134-147.
[7] Chon SY，Hassanain HH，Gupta SL. Cooperative role of interferon regulatory factor 1 and p91 （STAT1） response elements in interferon-γ-inducible expression of human indoleamine 2，3-dioxygenase gene[J]. J Biol Chem，1996，271（29）：17247-17252.
[8] Robinson CM，Hale PT，Carlin JM. The role of IFN-γ and TNF-α-responsive regulatory elements in the synergistic induction of indoleamine dioxygenase[J]. J Interferon Cytokine Res，2005，25（1）：20-30.
（收稿日期：2009-03-02）