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摘要：【目的】分析木薯Class III过氧化物酶（POD）基因（MePOD）的序列特征，并检测乙烯（ET）和茉莉酸（JA）逆境信号对其表达的影响，为研究木薯对逆境胁迫的响应和调控模式及培育抗逆新品种提供理论依据。【方法】从木薯基因组数据库中获取MePOD基因序列并进行分析；以木薯品种华南8号悬浮培养细胞为材料，利用实时荧光定量PCR（qPCR）检测木薯MePOD基因在乙烯利和茉莉酸甲酯（MeJA）处理后的表达特性。【结果】MePOD基因编码区含4个外显子和3个内含子；转录起始位点位于起始密码子上游1061 bp处；启动子区域含多个顺式作用元件，但无ET和JA响应元件。MePOD蛋白由331个氨基酸组成，分子量为37.476 kD，理论等电点为8.66；有一个含信号肽的跨膜结构，是一种阳离子分泌型Class III POD。系统发育进化树分析结果表明，木薯MePOD蛋白与大戟科橡胶树（Hevea brasiliensis，ADR70870.1）的亲缘关系最近，且除两种裸子植物外，其他17种被子植物聚为一类，且同一科植物进一步相聚，此结果与进化地位一致。qPCR检测结果表明，MeJA诱导0.5 h后，MePOD基因表达量整体上呈先升高后下降的变化趋势，而乙烯利诱導0.5 h后其表达量呈缓慢上升的变化趋势，但整体上维持在本底水平之下。【结论】JA和ET逆境信号不直接通过相应响应元件上调MePOD基因表达，而与其他激素信号进行综合调控，并进一步参与植物体内的抗氧化过程。
关键词： 木薯；过氧化物酶（POD）基因；乙烯（ET）；茉莉酸（JA）；表达分析
中图分类号： S533 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2016）12-2009-06
Abstract：【Objective】The present study was conducted to analyze sequence characteristics of Manihot esculenta Crantz Class III peroxidase gene（MePOD） and detect its expression stimulated by two stress signals viz.， ethylene（ET） and jasmonic acid（JA） in cassava， in order to lay theoretical foundation for studying response of M. esculenta Crantz to stress and breeding new resistant varieties. 【Method】MePOD gene sequence was obtained from Cassava Genome Database. Using suspension cultured cells of M. esculenta Crantz variety SC8 as materials， expression characteristics of MePOD gene were investigated by real-time quantitative PCR（qPCR） technique after being induced by ethephon and methyl jasmonate（MeJA）. 【Result】Results showed that， coding region of MePOD gene contained four extrons and three introns， and its transcription initiation site was located at the upstream 1061 bp of start codon. There were many cis-acting elements excluding JA and ET responsive elements in promoter region of MePOD gene. Furthermore， MePOD protein was composed of 331 amino acids and 37.476 kD in molecular weight， theoretical isoelectric point was 8.66， and it contained a transmembrane structure with a signal peptid， so it was secretory cationic Class III POD. Phylogenetic tree analysis showed that， MePOD protein of M. esculenta Crantz had a close genetic relationship with POD of Hevea brasiliensis（ADR70870.1） belonging to Euphorbiaceae. Seventeen species of angiosperms were clustered into one category except two species of gymnospermae， and the same family was clustered together. The above results were consistent with evolutionary status. qPCR results showed that， MePOD gene expression increased firstly and then decreased after being induced by MeJA for 0.5 h， whereas MePOD gene expression increased slowly but maintained below background level after being induced by ethephon for 0.5 h. 【Conclusion】In the absence of JA and ET responsive elements， MePOD gene can not be up-regulated directly， but can be regulated by integrating different hormones signals， and then participate in antioxidation processes. Key words： Manihot esculenta Crantz； peroxidasen（POD） gene； ethephon（ET）； jasmonic acid（JA）； expression analysis
0 引言
【研究意义】木薯（Manihot esculenta Crantz）属于大戟科（Euphorbiaceae）木薯属（Manihot），原产热带南美洲（Laban et al.，2013），是第六大粮食作物，也是世界三大薯类作物之一，具有高光效、高淀粉产量、抗干旱、耐贫瘠等特性（张何芳等，2012）。逆境胁迫影响植物的生长发育，但植物会在进化过程中形成相应的抗胁迫机制，并通过生理生化指标的改变来响应各种胁迫（Cheng et al.，2013）。过氧化物酶（POD）是一种重要的植物抗氧化保护酶，与植物的抗逆性密切相关，可作为植物应对逆境胁迫的生物标记之一，其中Class III POD是一种植物特有的分泌型蛋白酶，参与生长素代谢、细胞壁延伸和加厚、活性氧和活性氮代谢及抗病等生理活动（孟艳艳等，2011）。因此，研究POD基因在木薯逆境中的响应模式和抗性调控机制对提高木薯抗逆性和产量具有重要意义。【前人研究进展】Class III POD是一个多基因家族，具有多种同工酶和酶促反应类型，参与植物的多个生命活动（Passardi et al.，2005）。1965年，Hinman和Lang发现Class III POD参与吲哚乙酸（IAA）代谢，具有催化IAA氧化脱羧的能力（Beffa et al.，1990），并证实Class III POD参与植物激素代谢（Hiraga et al.，2001）。当植株受到病原菌侵染时，Class III POD基因表达水平上调（Almagro et al.，2009），表达蛋白形成结构障碍或产生大量活性氧（ROS）和活性氮（RNS），构成一个高毒性区，从而抑制侵染部位的扩大（Passardi et al.，2005），其中高等植物中Class III POD基因表达受真菌（Harrison et al.，1995）、病毒（Hiraga et al.，2000）、细菌（Hilaire et al.，2001）和毒素（Jansen et al.，2004）等诱导，表明Class III POD参与了植物的抗病过程（Ostergaard et al.，2000；Hiraga et al.，2001；Passardi et al.，2004b）。由于Class III POD能催化聚合木质素亚基分子在氧化连接过程中产生的酚类物质，因此Class III POD也参与了木质素合成（Barcelo et al.，2007），但此过程依赖于H2O2的存在（Weir et al.，2005）。此外，Class III POD还参与了细胞壁的延伸和加厚（Bernards et al.，2004）、纤维伸长（Mei et al.，2009）等过程。【本研究切入点】目前，已有学者研究了番茄（Thaler，1999）、枸杞（段文昌等，2012）、棉花（杨世勇等，2013a，2013b）、青杨（越慧芳等，2013）和长白落叶松（王杰等，2015）等作物中逆境信号分子对Class III类POD基因的表达调控作用，但鲜见木薯POD基因响应茉莉酸（JA）和乙烯（ET）信号的文献报道。【拟解决的关键问题】对木薯Class III POD基因（MePOD）（Manes.16G007300）进行序列分析及乙烯利与茉莉酸甲酯（MeJA）诱导表达分析，研究ET和JA信号分子对MePOD基因表达的影响及其表达特性，为进一步研究木薯对逆境胁迫的响应和调控模式打下基础。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
木薯品种华南8号（SC8）悬浮培养细胞由叶片愈伤组织液体悬浮培养获得，保存于中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所。总RNA小量制备试剂盒购自美国Axygen公司；PrimeScriptTM Reverse Transcriptase反转录试剂盒和SYBR Premix Ex TaqTM II（Perfect Real Time）购自宝生物工程（大连）有限公司（TaKaRa）。
1. 2 试验方法
1. 2. 1 MePOD基因结构及启动子区序列分析 根据JGI木薯基因组数据库MePOD的CDS序列和DNA序列（Prochnik et al.， 2012），用GSDS分析其内含子相位，用TSSP分析转录起始位点，用PlantCARE综合分析启动子区序列，寻找顺式作用元件位点。
1. 2. 2 MePOD蛋白分析 利用BLAST对MePOD氨基酸序列进行比对分析；利用PortParam预测其蛋白分子量和等电点，利用InterPro预测结构域，利用TMHMM Server进行跨膜区预测，利用SignalP预测信号肽，利用PSIPRED预测二级结构，利用Swiss-model预测三级结构，利用PFP预测蛋白功能。
1. 2. 3 序列比对和进化树分析 利用MEGA 6.0对18种作物与木薯进行POD氨基酸序列比对，并使用邻接（Neighbor-joining，N-J）法构建系统发育进化树。使用Bootstrap方法1000次重复对系统发育进化树进行验证。
1. 2. 4 诱导表达 吸取1 mL处于指数增长期的悬浮培养细胞于离心管中，置于25 ℃摇床稳定0.5 h，共3组，其中2组分别用400 μL/L的乙烯利和MeJA处理，另1组未处理为对照，每组设3个重复。取处理后0.5、1.0、2.0、4.0和8.0 h共5个时间点的样品，微离心后，棄上清液，于氮液速冻后-80 ℃备用保存。
1. 2. 5 qPCR检测 按照总RNA小量制备试剂盒说明提取样品总RNA，利用PrimeScriptTM Reverse Transcriptase反转录试剂盒反转录合成cDNA。最后，使用SYBR Premix Ex TaqTM II（Perfect Real Time）实时定量试剂盒检测MePOD基因在悬浮培养细胞中乙烯利和MeJA诱导表达情况，以18S rRNA为内参。qPCR反应体系10.0 μL： 2×SYBR Premix Ex Taq 5.0 μL，cDNA模板1.0 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.3 μL，以ddH2O补足至10.0 μL。扩增程序：94 ℃预变性1 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，进行40个循环。所用MePOD基因和18S rRNA引物均用Primer Premier 5.0设计，由Invitrogen公司合成，引物序列如表1所示。 2 结果与分析
2. 1 基因序列分析结果
MePOD基因序列（图1和表2）分析发现，MePOD基因编码区含4个外显子和3个内含子；转录起始位点位于起始密码子上游1061 bp处；启动子区域包含典型启动子调控元件CAAT-box和TATA-box、多个光响应顺式元件及热胁迫响应的顺式元件、分生组织特异活化的顺式作用元件、HvMYB结合位点各1个等，但无ET响应元件和JA响应元件。
2. 2 蛋白结构分析结果
MePOD蛋白由331个氨基酸组成，分子量为37.476 kD，理论等电点为8.66。结构域分析结果表明，MePOD属于Plant_peroxidase_like亚家族，具有Secretory_peroxidase结构域。同源性比对分析发现，其与阳离子型POD、分泌型POD和Class III POD相似度最高。跨膜区预测分析结果显示，MePOD蛋白可能有一个跨膜结构，且含信号肽结构。二级结构预测结果显示，MePOD蛋白含有15个螺旋结构和1个折叠结构，可参考其三级结构（图2）。蛋白功能预测结果显示，MePOD蛋白最符合Gene Ontology（GO）中的GO：0004601条目，具有POD活性。
2. 3 系统发育进化树分析结果
从系统发育进化树（图3）可看出，木薯MePOD蛋白与木本植物如橡胶树（Hevea brasiliensis，ADR70870.1）、木榄（Bruguiera gymnorhiza，ADD54644.1）和毛白杨（Populus tomentosa，AKE81099.1）亲缘关系较近，其中与同为大戟科的橡胶树最近，处于同一分支。豆科的蒺藜苜蓿（Medicago truncatula，XP_003610431.1）和鹰嘴豆（Cicer arietinum，NP_001266136.1）处于同一分支，大豆（Glycine max，NP_001237601.1）和菜豆（Phaseolus vulgaris，AHA84196.1）处于同一分支，且四者处于同一大分支上。锦葵科的木棉（Gossypium arboreum，KHG03947.1）和陆地棉（Gossypium hirsutum，AAA99868.1）处于同一分支。山茶科的油茶（Camellia oleifera，ACT21094.1）与桑科的川桑（Morus notabilis，XP_010092206.1）亲缘关系也较近，木薯MePOD蛋白与马鞭草科的海榄雌（Avicennia marina，BAB16317.1）、夹竹桃科的长春花（Catharanthus roseus，AAY-26520.1）亲缘关系最远。其他作物如可可（Theobroma cacao，XP_007026071.1）、拟南芥（Arabidopsis thaliana，NP_ 567641.1）、文心兰（Oncidium hybrid cultivar，ABC- 02343.1）均单独分支。裸子植物云杉（Picea abies，CAD92856.1）和黑松（Pinus thunbergii，AHN05533.1）位于進化树基部，是较被子植物更原始的类群。综上所述，除两种裸子植物外，其他17种被子植物聚为一类，且同一科植物进一步相聚，此结果与进化地位一致。
2. 4 基因表达水平检测结果
为排除MePOD基因本底变化造成的影响，将MeJA和乙烯利诱导后的MePOD基因表达量值除以对照的表达量。拟合曲线显示MePOD基因表达在乙烯利和MeJA诱导后呈不同的响应趋势（图4），MeJA诱导0.5 h后整体上呈先升高后下降的变化趋势，乙烯利诱导0.5 h后其表达呈缓慢上升的变化趋势，但整体上维持在本底水平之下。
3 讨论
细胞是植物基本的结构和功能单位，具有所有遗传信息。悬浮培养细胞具有对外界信号响应一致的特点，尤其适用于相对表达量不高、易被背景淹没的基因表达分析研究。本研究中，MePOD基因在0.5 h内对逆境信号分子作出响应进行诱导表达，且重复间误差均较小，表明供试材料适用于其基因表达分析。
Class III POD与Class I POD是胞内抗坏血酸过氧化物酶（APX）共同的原核起源，但Class III POD是分泌到细胞壁或周围介质中。Class I POD仍保存着细菌的基因序列信息，Class III POD则在进化中发生了基因变异，仅保存了蛋白结构上的相似性（Schuller et al.，1996）。所有陆生植物为适应高氧的陆生生活均进化产生Class III POD（Passardi et al.， 2004a）。这个多基因家族的进化与植物组织结构的复杂性、生存环境及病原物的多样性密切相关。本研究通过对木薯MePOD蛋白生物信息学分析，发现其属于Plant_ peroxidase_like亚家族，具有Secretory_peroxidase结构域，是一种分泌型POD；其理论等电点为8.66，是一种碱性阳离子型POD。通过同源比对也发现其与阳离子型POD、分泌型POD和Class III POD的相似度最高。由此推测，MePOD是一种属于Class III的阳离子分泌型POD。
JA和ET是植物逆境响应的信号分子。其中，JA具有诱导植物防御基因表达、调控植物对机械伤害、盐害及紫外线照射等非生物胁迫反应的功能（Wasternack and Hause， 2013）。ET可引起植物多种生理效应和形态建成，如对环境胁迫反应、偏上生长、器官衰老与脱落、种子萌发、果实成熟等。此外，多种调控果实后熟、植物衰老的酶及由伤害或胁迫诱导的防御蛋白基因序列均含ET响应元件（Johnson and Ecker，1998；Bleecker and Kende，2000）。本研究的qPCR检测结果显示，经乙烯利和MeJA处理后，MePOD基因表达呈不同的响应趋势，MeJA处理后0.5～4.0 h MePOD基因表达上调，之后又逐渐回落，而经乙烯利处理后，MePOD基因表达整体上维持在本底水平之下。由启动子区元件分析结果显示，MePOD基因既无JA响应元件，又无ET响应元件，表明其不受ET和JA信号的直接调控，而是间接调控。由此推测，JA信号激活了其他信号途径，从而引起MePOD基因表达上调。 大量研究证实，JA信号能引起POD基因表达上调，如外源JA或MeJA可刺激番茄（Thaler，1999）、枸杞（段文昌等，2012）、青杨（越慧芳等，2013）、棉花（杨世勇等，2013a，2013b）和长白落叶松（王杰等，2015）的POD酶活性明显增加，以增强植物抗性，与本研究结论一致。本研究还发现，ET信号的作用却相反，说明存在其他机制造成其下调并维持在低表达水平。已有研究证明，ET对抗氧化酶的调控是以H2O2为中介（孟艳艳等，2014），但ET和H2O2在抗氧化反应中的信号传导机理还需进一步研究。植物中JA和ET与其他信号转导通路间激素的交叉互作在整个生育周期内的不同组织器官间、不同类型细胞中一直存在（Johnson and Ecker，1998；Bleecker and Kende，2000；Wasternack and Hause， 2013），表明不同激素信号的整合共同调控了植物的生长发育、对环境的响应及衰老死亡。本研究发现，MePOD基因的启动子区还有其他多种响应元件，推测ET和JA与其他不同激素的交叉互作产生了不同的调控模式，最终造成MePOD基因表达量的差异。虽然本研究已明确木薯的MePOD基因可受到JA和ET信号影响，并初步确定其表达特性，但其还能影响哪些生物学过程及如何影响，仍需进一步探究。
4 结论
JA和ET逆境信号不直接通过相应响应元件上调MePOD基因表达，而与其他激素信号进行综合调控，并进一步参与植物体内的抗氧化过程。
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（責任编辑 陈 燕）
关键词： 木薯；过氧化物酶（POD）基因；乙烯（ET）；茉莉酸（JA）；表达分析
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Abstract：【Objective】The present study was conducted to analyze sequence characteristics of Manihot esculenta Crantz Class III peroxidase gene（MePOD） and detect its expression stimulated by two stress signals viz.， ethylene（ET） and jasmonic acid（JA） in cassava， in order to lay theoretical foundation for studying response of M. esculenta Crantz to stress and breeding new resistant varieties. 【Method】MePOD gene sequence was obtained from Cassava Genome Database. Using suspension cultured cells of M. esculenta Crantz variety SC8 as materials， expression characteristics of MePOD gene were investigated by real-time quantitative PCR（qPCR） technique after being induced by ethephon and methyl jasmonate（MeJA）. 【Result】Results showed that， coding region of MePOD gene contained four extrons and three introns， and its transcription initiation site was located at the upstream 1061 bp of start codon. There were many cis-acting elements excluding JA and ET responsive elements in promoter region of MePOD gene. Furthermore， MePOD protein was composed of 331 amino acids and 37.476 kD in molecular weight， theoretical isoelectric point was 8.66， and it contained a transmembrane structure with a signal peptid， so it was secretory cationic Class III POD. Phylogenetic tree analysis showed that， MePOD protein of M. esculenta Crantz had a close genetic relationship with POD of Hevea brasiliensis（ADR70870.1） belonging to Euphorbiaceae. Seventeen species of angiosperms were clustered into one category except two species of gymnospermae， and the same family was clustered together. The above results were consistent with evolutionary status. qPCR results showed that， MePOD gene expression increased firstly and then decreased after being induced by MeJA for 0.5 h， whereas MePOD gene expression increased slowly but maintained below background level after being induced by ethephon for 0.5 h. 【Conclusion】In the absence of JA and ET responsive elements， MePOD gene can not be up-regulated directly， but can be regulated by integrating different hormones signals， and then participate in antioxidation processes. Key words： Manihot esculenta Crantz； peroxidasen（POD） gene； ethephon（ET）； jasmonic acid（JA）； expression analysis
0 引言
【研究意义】木薯（Manihot esculenta Crantz）属于大戟科（Euphorbiaceae）木薯属（Manihot），原产热带南美洲（Laban et al.，2013），是第六大粮食作物，也是世界三大薯类作物之一，具有高光效、高淀粉产量、抗干旱、耐贫瘠等特性（张何芳等，2012）。逆境胁迫影响植物的生长发育，但植物会在进化过程中形成相应的抗胁迫机制，并通过生理生化指标的改变来响应各种胁迫（Cheng et al.，2013）。过氧化物酶（POD）是一种重要的植物抗氧化保护酶，与植物的抗逆性密切相关，可作为植物应对逆境胁迫的生物标记之一，其中Class III POD是一种植物特有的分泌型蛋白酶，参与生长素代谢、细胞壁延伸和加厚、活性氧和活性氮代谢及抗病等生理活动（孟艳艳等，2011）。因此，研究POD基因在木薯逆境中的响应模式和抗性调控机制对提高木薯抗逆性和产量具有重要意义。【前人研究进展】Class III POD是一个多基因家族，具有多种同工酶和酶促反应类型，参与植物的多个生命活动（Passardi et al.，2005）。1965年，Hinman和Lang发现Class III POD参与吲哚乙酸（IAA）代谢，具有催化IAA氧化脱羧的能力（Beffa et al.，1990），并证实Class III POD参与植物激素代谢（Hiraga et al.，2001）。当植株受到病原菌侵染时，Class III POD基因表达水平上调（Almagro et al.，2009），表达蛋白形成结构障碍或产生大量活性氧（ROS）和活性氮（RNS），构成一个高毒性区，从而抑制侵染部位的扩大（Passardi et al.，2005），其中高等植物中Class III POD基因表达受真菌（Harrison et al.，1995）、病毒（Hiraga et al.，2000）、细菌（Hilaire et al.，2001）和毒素（Jansen et al.，2004）等诱导，表明Class III POD参与了植物的抗病过程（Ostergaard et al.，2000；Hiraga et al.，2001；Passardi et al.，2004b）。由于Class III POD能催化聚合木质素亚基分子在氧化连接过程中产生的酚类物质，因此Class III POD也参与了木质素合成（Barcelo et al.，2007），但此过程依赖于H2O2的存在（Weir et al.，2005）。此外，Class III POD还参与了细胞壁的延伸和加厚（Bernards et al.，2004）、纤维伸长（Mei et al.，2009）等过程。【本研究切入点】目前，已有学者研究了番茄（Thaler，1999）、枸杞（段文昌等，2012）、棉花（杨世勇等，2013a，2013b）、青杨（越慧芳等，2013）和长白落叶松（王杰等，2015）等作物中逆境信号分子对Class III类POD基因的表达调控作用，但鲜见木薯POD基因响应茉莉酸（JA）和乙烯（ET）信号的文献报道。【拟解决的关键问题】对木薯Class III POD基因（MePOD）（Manes.16G007300）进行序列分析及乙烯利与茉莉酸甲酯（MeJA）诱导表达分析，研究ET和JA信号分子对MePOD基因表达的影响及其表达特性，为进一步研究木薯对逆境胁迫的响应和调控模式打下基础。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
木薯品种华南8号（SC8）悬浮培养细胞由叶片愈伤组织液体悬浮培养获得，保存于中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所。总RNA小量制备试剂盒购自美国Axygen公司；PrimeScriptTM Reverse Transcriptase反转录试剂盒和SYBR Premix Ex TaqTM II（Perfect Real Time）购自宝生物工程（大连）有限公司（TaKaRa）。
1. 2 试验方法
1. 2. 1 MePOD基因结构及启动子区序列分析 根据JGI木薯基因组数据库MePOD的CDS序列和DNA序列（Prochnik et al.， 2012），用GSDS分析其内含子相位，用TSSP分析转录起始位点，用PlantCARE综合分析启动子区序列，寻找顺式作用元件位点。
1. 2. 2 MePOD蛋白分析 利用BLAST对MePOD氨基酸序列进行比对分析；利用PortParam预测其蛋白分子量和等电点，利用InterPro预测结构域，利用TMHMM Server进行跨膜区预测，利用SignalP预测信号肽，利用PSIPRED预测二级结构，利用Swiss-model预测三级结构，利用PFP预测蛋白功能。
1. 2. 3 序列比对和进化树分析 利用MEGA 6.0对18种作物与木薯进行POD氨基酸序列比对，并使用邻接（Neighbor-joining，N-J）法构建系统发育进化树。使用Bootstrap方法1000次重复对系统发育进化树进行验证。
1. 2. 4 诱导表达 吸取1 mL处于指数增长期的悬浮培养细胞于离心管中，置于25 ℃摇床稳定0.5 h，共3组，其中2组分别用400 μL/L的乙烯利和MeJA处理，另1组未处理为对照，每组设3个重复。取处理后0.5、1.0、2.0、4.0和8.0 h共5个时间点的样品，微离心后，棄上清液，于氮液速冻后-80 ℃备用保存。
1. 2. 5 qPCR检测 按照总RNA小量制备试剂盒说明提取样品总RNA，利用PrimeScriptTM Reverse Transcriptase反转录试剂盒反转录合成cDNA。最后，使用SYBR Premix Ex TaqTM II（Perfect Real Time）实时定量试剂盒检测MePOD基因在悬浮培养细胞中乙烯利和MeJA诱导表达情况，以18S rRNA为内参。qPCR反应体系10.0 μL： 2×SYBR Premix Ex Taq 5.0 μL，cDNA模板1.0 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.3 μL，以ddH2O补足至10.0 μL。扩增程序：94 ℃预变性1 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，进行40个循环。所用MePOD基因和18S rRNA引物均用Primer Premier 5.0设计，由Invitrogen公司合成，引物序列如表1所示。 2 结果与分析
2. 1 基因序列分析结果
MePOD基因序列（图1和表2）分析发现，MePOD基因编码区含4个外显子和3个内含子；转录起始位点位于起始密码子上游1061 bp处；启动子区域包含典型启动子调控元件CAAT-box和TATA-box、多个光响应顺式元件及热胁迫响应的顺式元件、分生组织特异活化的顺式作用元件、HvMYB结合位点各1个等，但无ET响应元件和JA响应元件。
2. 2 蛋白结构分析结果
MePOD蛋白由331个氨基酸组成，分子量为37.476 kD，理论等电点为8.66。结构域分析结果表明，MePOD属于Plant_peroxidase_like亚家族，具有Secretory_peroxidase结构域。同源性比对分析发现，其与阳离子型POD、分泌型POD和Class III POD相似度最高。跨膜区预测分析结果显示，MePOD蛋白可能有一个跨膜结构，且含信号肽结构。二级结构预测结果显示，MePOD蛋白含有15个螺旋结构和1个折叠结构，可参考其三级结构（图2）。蛋白功能预测结果显示，MePOD蛋白最符合Gene Ontology（GO）中的GO：0004601条目，具有POD活性。
2. 3 系统发育进化树分析结果
从系统发育进化树（图3）可看出，木薯MePOD蛋白与木本植物如橡胶树（Hevea brasiliensis，ADR70870.1）、木榄（Bruguiera gymnorhiza，ADD54644.1）和毛白杨（Populus tomentosa，AKE81099.1）亲缘关系较近，其中与同为大戟科的橡胶树最近，处于同一分支。豆科的蒺藜苜蓿（Medicago truncatula，XP_003610431.1）和鹰嘴豆（Cicer arietinum，NP_001266136.1）处于同一分支，大豆（Glycine max，NP_001237601.1）和菜豆（Phaseolus vulgaris，AHA84196.1）处于同一分支，且四者处于同一大分支上。锦葵科的木棉（Gossypium arboreum，KHG03947.1）和陆地棉（Gossypium hirsutum，AAA99868.1）处于同一分支。山茶科的油茶（Camellia oleifera，ACT21094.1）与桑科的川桑（Morus notabilis，XP_010092206.1）亲缘关系也较近，木薯MePOD蛋白与马鞭草科的海榄雌（Avicennia marina，BAB16317.1）、夹竹桃科的长春花（Catharanthus roseus，AAY-26520.1）亲缘关系最远。其他作物如可可（Theobroma cacao，XP_007026071.1）、拟南芥（Arabidopsis thaliana，NP_ 567641.1）、文心兰（Oncidium hybrid cultivar，ABC- 02343.1）均单独分支。裸子植物云杉（Picea abies，CAD92856.1）和黑松（Pinus thunbergii，AHN05533.1）位于進化树基部，是较被子植物更原始的类群。综上所述，除两种裸子植物外，其他17种被子植物聚为一类，且同一科植物进一步相聚，此结果与进化地位一致。
2. 4 基因表达水平检测结果
为排除MePOD基因本底变化造成的影响，将MeJA和乙烯利诱导后的MePOD基因表达量值除以对照的表达量。拟合曲线显示MePOD基因表达在乙烯利和MeJA诱导后呈不同的响应趋势（图4），MeJA诱导0.5 h后整体上呈先升高后下降的变化趋势，乙烯利诱导0.5 h后其表达呈缓慢上升的变化趋势，但整体上维持在本底水平之下。
3 讨论
细胞是植物基本的结构和功能单位，具有所有遗传信息。悬浮培养细胞具有对外界信号响应一致的特点，尤其适用于相对表达量不高、易被背景淹没的基因表达分析研究。本研究中，MePOD基因在0.5 h内对逆境信号分子作出响应进行诱导表达，且重复间误差均较小，表明供试材料适用于其基因表达分析。
Class III POD与Class I POD是胞内抗坏血酸过氧化物酶（APX）共同的原核起源，但Class III POD是分泌到细胞壁或周围介质中。Class I POD仍保存着细菌的基因序列信息，Class III POD则在进化中发生了基因变异，仅保存了蛋白结构上的相似性（Schuller et al.，1996）。所有陆生植物为适应高氧的陆生生活均进化产生Class III POD（Passardi et al.， 2004a）。这个多基因家族的进化与植物组织结构的复杂性、生存环境及病原物的多样性密切相关。本研究通过对木薯MePOD蛋白生物信息学分析，发现其属于Plant_ peroxidase_like亚家族，具有Secretory_peroxidase结构域，是一种分泌型POD；其理论等电点为8.66，是一种碱性阳离子型POD。通过同源比对也发现其与阳离子型POD、分泌型POD和Class III POD的相似度最高。由此推测，MePOD是一种属于Class III的阳离子分泌型POD。
JA和ET是植物逆境响应的信号分子。其中，JA具有诱导植物防御基因表达、调控植物对机械伤害、盐害及紫外线照射等非生物胁迫反应的功能（Wasternack and Hause， 2013）。ET可引起植物多种生理效应和形态建成，如对环境胁迫反应、偏上生长、器官衰老与脱落、种子萌发、果实成熟等。此外，多种调控果实后熟、植物衰老的酶及由伤害或胁迫诱导的防御蛋白基因序列均含ET响应元件（Johnson and Ecker，1998；Bleecker and Kende，2000）。本研究的qPCR检测结果显示，经乙烯利和MeJA处理后，MePOD基因表达呈不同的响应趋势，MeJA处理后0.5～4.0 h MePOD基因表达上调，之后又逐渐回落，而经乙烯利处理后，MePOD基因表达整体上维持在本底水平之下。由启动子区元件分析结果显示，MePOD基因既无JA响应元件，又无ET响应元件，表明其不受ET和JA信号的直接调控，而是间接调控。由此推测，JA信号激活了其他信号途径，从而引起MePOD基因表达上调。 大量研究证实，JA信号能引起POD基因表达上调，如外源JA或MeJA可刺激番茄（Thaler，1999）、枸杞（段文昌等，2012）、青杨（越慧芳等，2013）、棉花（杨世勇等，2013a，2013b）和长白落叶松（王杰等，2015）的POD酶活性明显增加，以增强植物抗性，与本研究结论一致。本研究还发现，ET信号的作用却相反，说明存在其他机制造成其下调并维持在低表达水平。已有研究证明，ET对抗氧化酶的调控是以H2O2为中介（孟艳艳等，2014），但ET和H2O2在抗氧化反应中的信号传导机理还需进一步研究。植物中JA和ET与其他信号转导通路间激素的交叉互作在整个生育周期内的不同组织器官间、不同类型细胞中一直存在（Johnson and Ecker，1998；Bleecker and Kende，2000；Wasternack and Hause， 2013），表明不同激素信号的整合共同调控了植物的生长发育、对环境的响应及衰老死亡。本研究发现，MePOD基因的启动子区还有其他多种响应元件，推测ET和JA与其他不同激素的交叉互作产生了不同的调控模式，最终造成MePOD基因表达量的差异。虽然本研究已明确木薯的MePOD基因可受到JA和ET信号影响，并初步确定其表达特性，但其还能影响哪些生物学过程及如何影响，仍需进一步探究。
4 结论
JA和ET逆境信号不直接通过相应响应元件上调MePOD基因表达，而与其他激素信号进行综合调控，并进一步参与植物体内的抗氧化过程。
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（責任编辑 陈 燕）