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[摘要] 目的 探讨DOG1在常见涎腺肿瘤中的表达及其诊断价值。 方法 应用免疫组织化学EnVision二步法检测DOG1在20例正常涎腺组织及154例14种常见涎腺肿瘤中的表达情况。 结果 17例腺泡细胞癌均呈DOG1阳性，其中14例（82.4%）呈弥漫阳性；85.7%（6/7）的基底细胞腺癌见DOG1染色，其中3例（42.9%）呈弥漫阳性；42.9%为（3/7）多形性低度恶性腺癌、37.5%为（6/16）基底细胞腺瘤、30%为（6/20）腺样囊性癌、25%（5/20）为多形性腺瘤、21.1%（4/19）为黏液表皮样癌呈DOG1部分阳性表达，8例为嗜酸细胞瘤/癌、5例为非特异性腺癌、3例为上皮-肌上皮癌、12例为肌上皮瘤/癌、20例Warthin瘤均DOG1阴性。 结论 DOG1可以与消化PAS联合应用于腺泡细胞癌诊断及鉴别诊断；基底细胞腺癌中DOG1表达明显高于基底细胞腺瘤（P=0.0162），DOG1可能可以用于基底细胞腺瘤与基底细胞腺癌的鉴别。
[关键词] 涎腺肿瘤；腺泡细胞癌；基底细胞腺癌；DOG1；免疫组化
[中图分类号] R739.87 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2014）33-0068-04
[Abstract] Objective To investigate the expression of DOG1 in common salivary gland tumors and its diagnostic value. Methods Immunohistochemistry by EnVision Doublestain Kit was used to detect the expression of DOG1 in 20 normal salivary tissues and 154 common salivary gland tumors（a total of 14 types）. Results Seventeen patients with acinic cell carcinoma were all DOG1-positive， 82.4%（14/17） were positively diffuse； DOG1 staining was noted in 85.7%（6/7） with basal cell adenocarcinoma， 3 of whom （42.9%） were positively diffuse； 42.9%（3/7） with polymorphous low-grade adenocarcinoma， 37.5%（6/16） with basal cell adenoma， 30%（6/20） with adenoid cystic carcinoma and 25%（5/20） with pleomorphic adenoma and 21.1%（4/19） with mucoepidermoid carcinoma showed partial DOG1-positive expression； 8 with oncocytoma， 5 with adenocarcinoma not otherwise specified， 3 with epithelial-myoepithelial carcinoma， 12 with myoepithelioma or myoepithelial carcinoma， and 20 with Warthin's tumor were DOG1-negative. Conclusion Use of DOG1 in combination with digestive PAS can be applied in diagnosis and differential diagnosis of acinic cell carcinoma. Expression of DOG1 is markedly higher in basal cell adenocarcinoma than in basal cell adenoma（P=0.0162）. DOG1 is likely to be used in differentiation between basal cell adenoma and basal cell adenocarcinoma.
[Key words] Salivary gland neoplasms； Acinic cell carcinoma； Basal cell adenocarcinoma； DOG1； Immunohistochemisty
DOG1（Discovered on GIST-1）在胃肠道间质瘤（Gastrointestinal stromal tumor，GIST）中首先发现，是对GIST具有较高特异性及敏感性的标记物[1]，目前已常规地应用于GIST的诊断及鉴别诊断。近年研究显示DOG1是一种钙激活的氯离子通道蛋白[2]，在人体的多种肿瘤，如子宫内膜样腺癌、结直肠癌、头颈部鳞状细胞癌、软骨母细胞瘤中均有表达[3-5]。国外有作者研究发现DOG1可表达于部分涎腺肿瘤，其有助于涎腺肿瘤的诊断及鉴别诊断[6]，在国内，DOG1在涎腺肿瘤中的表达的研究尚未见报道。本组研究用免疫组化方法分析DOG1在14种常见涎腺肿瘤中的表达情况，探讨DOG1在涎腺肿瘤，尤其是腺泡细胞癌、基底细胞肿瘤病理诊断中的应用价值。
1 资料与方法
1.1 临床资料
选取温州医科大学附属三院病理数据库中1999年10月～2013年10月间手术切除的涎腺肿瘤及非肿瘤标本174例，其中包括腺泡细胞癌17例、多形性低度恶性腺癌7例、嗜酸细胞肿瘤8例（包括7例嗜酸细胞腺瘤和1例嗜酸细胞腺癌）、非特异性腺癌5例、基底细胞腺瘤16例、基底细胞腺癌7例、腺样囊性癌20例、多形性腺瘤20例、上皮-肌上皮癌3例、黏液表皮样癌19例、肌上皮肿瘤12例（包括肌上皮瘤10例和肌上皮癌2例）、Warthin瘤20例、正常涎腺标本20例（包括腮腺、颌下腺、舌下腺和小涎腺各5例）。所有病例均经2位高年资主治以上病理医师重新阅片、确诊，并剔除部分有争议的病例，除多形性腺瘤和Warthin瘤外，所有其他肿瘤的诊断均已得到相关免疫组化检测的支持。 1.2 免疫组织化学染色
DOG1单克隆抗体购自上海长岛生物技术有限公司，克隆号P31，稀释比1∶100，免疫组织化学采用EnVision二步法，所有标本均经10%中性福尔马林固定，常规石蜡包埋，切片厚度4 μm。以PH 9.0的EDTA为修复液在高压锅内进行抗原修复，以DAB为显色剂。以PBS代替一抗作为阴性对照，以胃GIST组织作为阳性对照组织。
1.3 免疫组织化学结果判断
DOG1 的结果判断参考Chenevert[6]的方法，即DOG1染色情况需综合评价阳性细胞的种类、阳性细胞的百分比、染色的强度、在细胞中的具体染色部位（如是细胞浆还是细胞膜，细胞膜则可进一步区分为游离面、侧面、基底面或全细胞膜染色）等。将少于2%细胞染色定为阴性染色、3%～50%细胞染色为部分阳性，50%以上细胞染色设为弥漫阳性。染色强度：将正常腮腺组织的浆液性腺泡的游离面细胞膜的染色强度定为2+，染色较之浅者为1+，较之深者为3+。
1.4统计学处理
数据处理使用SAS 9.3统计分析软件，采用Wilcoxon秩和检验，以P<0.05为显著性检验水准。
2 结果
2.1 DOG1在正常涎腺组织中的表达
共观察到153例正常涎腺组织，包括20例正常涎腺组织及133例肿瘤旁正常涎腺组织，其中79例来自腮腺、39例来自颌下腺、21例来自舌下腺及14例来自小涎腺。DOG1在涎腺浆液性腺泡中染色最为明显，呈较弥漫一致的中等强度（2+）的游离面及部分侧面细胞膜染色，基底面细胞膜偶见染色，胞浆、胞核无染色，故呈特征性的鹿角状外观（封三图3）。在黏液性腺泡以游离面细胞膜染色为主，侧面及基底面细胞膜染色相对较少，故多呈囊袋状外观（封三图4），且染色强度较弱（1+）。闰管也表现为游离面细胞膜染色，染色强度变化较大（呈1+～2+），纹状管和导管均DOG1阴性。上述正常的涎腺组织中均没有出现细胞浆的染色或全细胞膜染色，亦没有出现肌上皮细胞或基底细胞染色。
2.2 DOG在上皮性涎腺肿瘤中的表达（表1）
17例腺泡细胞癌均呈DOG1阳性，其中14例（82.4%）呈弥漫性（阳性细胞>50%）阳性，其余3例为部分阳性，阳性细胞约占细胞总数的20%～40%。大部分腺泡细胞癌阳性强度较正常腺泡更强且复杂，70.6%（12/17）的腺泡细胞癌显示3+的游离面或/和侧面细胞膜染色，该12例中均可以找到散在的全细胞膜阳性的细胞；88.2%（15/17）腺泡细胞癌出现胞浆染色，但强度较膜染色低，呈1+～2+（封三图5）。即使在同一个肿瘤内，不同的细胞类型和组织学生长类型间染色差异较大，其中以浆液性腺泡细胞染色最为明显，闰管样、实性/小叶状结构类型者相对较弱，空泡样、非特异性腺样者常出现阴性。
7例多形性低度恶性腺癌中有3例（42.9%）可见DOG1阳性，均呈低-中等强度（1+～2+）的部分阳性表达（10%～30%），其染色模式与闰管相类似，为游离面的细胞膜染色，未见胞浆染色，亦未见全细胞膜染色。8例嗜酸细胞肿瘤（包括7例嗜酸细胞腺瘤和1例嗜酸细胞腺癌）及5例非特异性腺癌均阴性。
2.3 DOG1在上皮-肌上皮/基底细胞性涎腺肿瘤中的表达（表1）
37.5%（6/16）的基底细胞腺瘤出现基底细胞成分的细胞浆染色，染色较浅（1+），且均为部分阳性（阳性细胞占10%～30%），其导管上皮成分几乎不染色。85.7%（6/7）的基底细胞腺癌见DOG1染色，其中3例（42.9%）呈弥漫性阳性，阳性率高于基底细胞腺瘤（P=0.0162），其阳性定位于基底细胞胞浆及导管上皮游离面胞膜（封三图6），强度亦略强于基底细胞腺瘤（1+～2+）。
仅在30%（6/20）的腺样囊性癌中观察到DOG1的染色，且分布较为局限，4例表现为局灶区（约10%～20%）肌上皮细胞胞浆1+染色；2例见环绕瘤巢周边的肌上皮细胞胞浆1+染色及导管上皮呈1+～2+游离面胞膜染色，瘤巢中央的肌上皮细胞及导管上皮细胞均阴性。
20例多形性腺瘤中仅5例（25%）出现部分性DOG1阳性，以上皮细胞游离面胞膜阳性为主，呈1+～2+染色强度，仅1例多形性腺瘤出现局灶区肌上皮细胞胞浆1+染色。所有3例上皮-肌上皮癌均未见DOG1染色。
2.4 DOG1在其他涎腺肿瘤中的表达（表1）
大部分黏液表皮样癌DOG1阴性，仅4例（21.1%）出现弱阳性（1+）表达，阳性范围都很局限（5%～20%），阳性部位主要定位于黏液细胞的游离面细胞膜。所有肌上皮瘤、肌上皮癌及Warthin瘤均未见DOG1染色。
3 讨论
DOG1最早于2004年由West[1]等在GIST中首先发现并加以命名，此后研究证实DOG1是一种钙激活的氯离子通道蛋白，其编码基因FLJ10261位于人染色体11q13区，包含26个外显子，编码960个氨基酸，DOG1蛋白约114Kb，是一个具有8个跨膜功能区的膜蛋白。DOG1也被命名为TMEM16A（transmembrane protein 16A）和ANO1（anoctamin 1）[2]。
DOG1在GIST中表达稳定，在90%以上的GIST出现DOG1的表达，其敏感性与特异性均与CD117相似甚至略高，约1/3的CD117阴性的GIST中可检到DOG1表达，其表达与GIST的C-kit基因和PDGFRA基因的突变无关[1，2，7]，因而DOG1最早被作为GIST诊断及鉴别诊断的重要抗体。钙激活的氯离子通道蛋白参与众多的生理过程[2，8]，如上皮细胞电解质和水的分泌、感觉转导、神经和心肌细胞兴奋性调节、血管紧张长度的调节等，且最新研究表明DOG1还与细胞生长、增殖有关[9，10]。DOG1作为钙激活的氯离子通道蛋白，其作用显然不应仅局限于作为GIST的标记物，研究表明DOG1在肝脏、胃粘膜、胆囊、膀胱、乳腺、前列腺、心脏、肺、胎盘和小肠等众多组织中均有表达。在涎腺方面，Yang[2]和Almaca[11]用鼠科动物模型均发现DOG1在涎腺中有表达且可能与涎腺正常分泌有关。Chenevert等发现涎腺组织中存在DOG1 mRNA的扩增，且DOG1在正常涎腺的腺泡细胞、闰管及部分涎腺肿瘤，如腺泡细胞癌、多形性低度恶性腺癌、腺样囊性癌、上皮-肌上皮癌等中有表达。 本组研究显示在正常涎腺中DOG1主要表达于浆液性腺泡，呈腺腔细胞的游离面胞膜及部分侧面胞膜的中等强度染色，显示独特的鹿角状外观；在黏液性腺泡中，DOG1染色强度相对较低，其染色部位与浆液性腺泡相似。从闰管处开始，DOG1表达迅速减少，仅部分闰管呈游离面细胞膜阳性到弱阳性表达，纹状管和导管均未见表达。正常涎腺的肌上皮细胞及基底细胞亦均未见DOG1表达。DOG1这种阳性表达的分布特点与其作为涎腺分泌时的跨膜阴离子通道的功能相符。
在所有涎腺常见肿瘤中，腺泡细胞癌的DOG1表达最强，其染色较之正常浆液性腺泡更强且更加复杂，主要表现为与正常浆液性腺泡相似的游离面胞膜强阳性染色，亦可见鹿角状外观，部分细胞可见全细胞膜染色或出现细胞浆染色，但总体上讲，其阳性特点与正常浆液性腺泡极其相似。这佐证了腺泡细胞癌起源于朝向腺泡细胞分化的闰管细胞或浆液性腺泡细胞[12]，同时，DOG1在腺泡细胞癌中的特征性的强阳性表达有助于腺泡细胞癌的诊断及鉴别诊断。目前腺泡细胞癌尚无特异性抗体，其诊断及鉴别诊断主要依靠形态学特征及特殊染色。典型的腺泡细胞癌在HE切片上呈浆液性腺泡分化，相对容易识别，但部分病例浆液性分化可不明显，此时常需要用消化PAS染色以显示其酶原颗粒。在少数情况下，PAS可不明显乃至阴性，且少数其他涎腺肿瘤也会出现一些胞浆内消化PAS阳性的粘液小滴，这就给腺泡细胞癌的诊断造成了困难，而应用DOG1染色可以将腺泡细胞癌与其易混淆肿瘤区分开来。
腺泡细胞癌除了最常见的浆液性腺泡分化外，还包括腺泡样、闰管样、空泡样、透明样和非特异性腺样等多种细胞类型及实性、小叶状、微囊性和滤泡样等多种组织生长类型，因而需与许多涎腺肿瘤进行鉴别，其中最常见的需要鉴别的是具有上皮分化特征的肿瘤。在这类肿瘤中，DOG1表现出非常好的特异性，所有的嗜酸细胞肿瘤和非特异性腺癌均DOG1阴性，仅少部分多形性低度恶性腺癌和黏液样表皮样癌DOG1阳性，但阳性细胞数较少，强度也明显低于腺泡细胞癌。另外，Warthin瘤极少需要与腺泡细胞癌鉴别，且其DOG1也总是阴性。
其他DOG1表达率较高的涎腺肿瘤为基底细胞肿瘤，在基底细胞腺瘤中DOG1的中阳性率为37.5%，其主要表达于基底细胞成分，呈局灶性的胞浆弱阳性表达，而基底细胞腺癌的总阳性率达85.7%，DOG1表达增强（1+～2+），范围更加广泛，近半数肿瘤出现弥漫阳性表达，阳性表达可见于基底细胞成分和导管上皮成分，其基底细胞呈胞浆染色，而导管上皮成分呈游离面胞膜染色，阳性模式类似于正常的闰管。虽然基底细胞肿瘤DOG1阳性率较高，但其均由导管上皮和基底细胞这两种细胞组成，其器官样生长模式可以通过常规光学显微镜观察到，而且上皮成分和基底细胞成分用S-100、SMA、P63、VIM等抗体染色时可以出现明显的对比，因而基底细胞肿瘤一般不需要借助DOG1与单一细胞的腺泡细胞癌进行鉴别。此外，我们注意到正常涎腺的肌上皮和基底细胞总是呈阴性表达，在基底细胞腺瘤中呈部分弱阳性表达，而在基底细胞腺癌中则呈弥漫的中等强度的阳性表达，这种正常组织、良性肿瘤、恶性肿瘤中DOG1表达递增的现象提示DOG1可能与基底细胞肿瘤的发生、增殖与恶变有关， DOG1可能可以用于基底细胞腺瘤与基底细胞腺癌间的鉴别诊断。
少部分腺样囊性癌和多形性腺瘤可见DOG1阳性，但阳性细胞数少，染色强度较弱，且二者都有较特征的HE形态及上皮-肌上皮双相细胞分化的特征及免疫组化表型，一般也不会对腺泡细胞癌诊断造成困难。本组研究仅收集到3例上皮-肌上皮癌，DOG1均为阴性表达， 与Chenevert报告中约半数的上皮-肌上皮癌表达DOG1的情况不符，其可能是本组研究上皮-肌上皮癌例数过少，抽样误差所致，但不论DOG1阳性与否，含有导管上皮和肌上皮两种细胞的上皮-肌上皮癌较容易通过HE及其他免疫组化抗体检测与腺泡细胞癌鉴别开来，一般无需借助DOG1。另外，所有的由单一肌上皮细胞组成的涎腺肿瘤，包括肌上皮瘤及肌上皮癌均DOG1阴性表达，易与腺泡细胞癌鉴别。
总之，DOG1在腺泡细胞癌中几乎总是呈弥漫强阳性表达，提示DOG1可以与消化PAS联合应用于腺泡细胞癌鉴别及鉴别诊断；基底细胞腺癌中DOG1表达明显高于基底细胞腺瘤，提示DOG1可能可以用于基底细胞腺瘤与基底细胞腺癌的鉴别。
[参考文献]
[1] West RB，Corless CL，Chen X，et al. The novel marker，DOG1，is expressed ubiquitously in gastrointestinal stromal tumors irrespective of KIT or PDGFRA mutation status[J]. Am J Pathol，2004，165（1）：107-113.
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[6] Chenevert J，Duvvuri U，Chiosea S，et al. DOG1： a novel marker of salivary acinar and intercalated duct differentiation[J]. Mod Pathol，2012，25（7）：919-929.
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[8] 刘雅妮，张海林. TMEM16A：钙激活氯通道研究进展[J]. 中国药理学通报，2011，（11）：1490-1493.
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[11] Almaca J，Tian Y，Aldehni F，et al. TMEM16 proteins produce volume-regulated chloride currents that are reduced in mice lacking TMEM16A[J]. J Biol Chem，2009， 284（42）：28571-28578.
[12] 刘红刚，高岩. 头颈部肿瘤病理学和遗传学[M].北京：人民卫生出版社，2006：255.
（收稿日期：2014-09-15）
[关键词] 涎腺肿瘤；腺泡细胞癌；基底细胞腺癌；DOG1；免疫组化
[中图分类号] R739.87 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2014）33-0068-04
[Abstract] Objective To investigate the expression of DOG1 in common salivary gland tumors and its diagnostic value. Methods Immunohistochemistry by EnVision Doublestain Kit was used to detect the expression of DOG1 in 20 normal salivary tissues and 154 common salivary gland tumors（a total of 14 types）. Results Seventeen patients with acinic cell carcinoma were all DOG1-positive， 82.4%（14/17） were positively diffuse； DOG1 staining was noted in 85.7%（6/7） with basal cell adenocarcinoma， 3 of whom （42.9%） were positively diffuse； 42.9%（3/7） with polymorphous low-grade adenocarcinoma， 37.5%（6/16） with basal cell adenoma， 30%（6/20） with adenoid cystic carcinoma and 25%（5/20） with pleomorphic adenoma and 21.1%（4/19） with mucoepidermoid carcinoma showed partial DOG1-positive expression； 8 with oncocytoma， 5 with adenocarcinoma not otherwise specified， 3 with epithelial-myoepithelial carcinoma， 12 with myoepithelioma or myoepithelial carcinoma， and 20 with Warthin's tumor were DOG1-negative. Conclusion Use of DOG1 in combination with digestive PAS can be applied in diagnosis and differential diagnosis of acinic cell carcinoma. Expression of DOG1 is markedly higher in basal cell adenocarcinoma than in basal cell adenoma（P=0.0162）. DOG1 is likely to be used in differentiation between basal cell adenoma and basal cell adenocarcinoma.
[Key words] Salivary gland neoplasms； Acinic cell carcinoma； Basal cell adenocarcinoma； DOG1； Immunohistochemisty
DOG1（Discovered on GIST-1）在胃肠道间质瘤（Gastrointestinal stromal tumor，GIST）中首先发现，是对GIST具有较高特异性及敏感性的标记物[1]，目前已常规地应用于GIST的诊断及鉴别诊断。近年研究显示DOG1是一种钙激活的氯离子通道蛋白[2]，在人体的多种肿瘤，如子宫内膜样腺癌、结直肠癌、头颈部鳞状细胞癌、软骨母细胞瘤中均有表达[3-5]。国外有作者研究发现DOG1可表达于部分涎腺肿瘤，其有助于涎腺肿瘤的诊断及鉴别诊断[6]，在国内，DOG1在涎腺肿瘤中的表达的研究尚未见报道。本组研究用免疫组化方法分析DOG1在14种常见涎腺肿瘤中的表达情况，探讨DOG1在涎腺肿瘤，尤其是腺泡细胞癌、基底细胞肿瘤病理诊断中的应用价值。
1 资料与方法
1.1 临床资料
选取温州医科大学附属三院病理数据库中1999年10月～2013年10月间手术切除的涎腺肿瘤及非肿瘤标本174例，其中包括腺泡细胞癌17例、多形性低度恶性腺癌7例、嗜酸细胞肿瘤8例（包括7例嗜酸细胞腺瘤和1例嗜酸细胞腺癌）、非特异性腺癌5例、基底细胞腺瘤16例、基底细胞腺癌7例、腺样囊性癌20例、多形性腺瘤20例、上皮-肌上皮癌3例、黏液表皮样癌19例、肌上皮肿瘤12例（包括肌上皮瘤10例和肌上皮癌2例）、Warthin瘤20例、正常涎腺标本20例（包括腮腺、颌下腺、舌下腺和小涎腺各5例）。所有病例均经2位高年资主治以上病理医师重新阅片、确诊，并剔除部分有争议的病例，除多形性腺瘤和Warthin瘤外，所有其他肿瘤的诊断均已得到相关免疫组化检测的支持。 1.2 免疫组织化学染色
DOG1单克隆抗体购自上海长岛生物技术有限公司，克隆号P31，稀释比1∶100，免疫组织化学采用EnVision二步法，所有标本均经10%中性福尔马林固定，常规石蜡包埋，切片厚度4 μm。以PH 9.0的EDTA为修复液在高压锅内进行抗原修复，以DAB为显色剂。以PBS代替一抗作为阴性对照，以胃GIST组织作为阳性对照组织。
1.3 免疫组织化学结果判断
DOG1 的结果判断参考Chenevert[6]的方法，即DOG1染色情况需综合评价阳性细胞的种类、阳性细胞的百分比、染色的强度、在细胞中的具体染色部位（如是细胞浆还是细胞膜，细胞膜则可进一步区分为游离面、侧面、基底面或全细胞膜染色）等。将少于2%细胞染色定为阴性染色、3%～50%细胞染色为部分阳性，50%以上细胞染色设为弥漫阳性。染色强度：将正常腮腺组织的浆液性腺泡的游离面细胞膜的染色强度定为2+，染色较之浅者为1+，较之深者为3+。
1.4统计学处理
数据处理使用SAS 9.3统计分析软件，采用Wilcoxon秩和检验，以P<0.05为显著性检验水准。
2 结果
2.1 DOG1在正常涎腺组织中的表达
共观察到153例正常涎腺组织，包括20例正常涎腺组织及133例肿瘤旁正常涎腺组织，其中79例来自腮腺、39例来自颌下腺、21例来自舌下腺及14例来自小涎腺。DOG1在涎腺浆液性腺泡中染色最为明显，呈较弥漫一致的中等强度（2+）的游离面及部分侧面细胞膜染色，基底面细胞膜偶见染色，胞浆、胞核无染色，故呈特征性的鹿角状外观（封三图3）。在黏液性腺泡以游离面细胞膜染色为主，侧面及基底面细胞膜染色相对较少，故多呈囊袋状外观（封三图4），且染色强度较弱（1+）。闰管也表现为游离面细胞膜染色，染色强度变化较大（呈1+～2+），纹状管和导管均DOG1阴性。上述正常的涎腺组织中均没有出现细胞浆的染色或全细胞膜染色，亦没有出现肌上皮细胞或基底细胞染色。
2.2 DOG在上皮性涎腺肿瘤中的表达（表1）
17例腺泡细胞癌均呈DOG1阳性，其中14例（82.4%）呈弥漫性（阳性细胞>50%）阳性，其余3例为部分阳性，阳性细胞约占细胞总数的20%～40%。大部分腺泡细胞癌阳性强度较正常腺泡更强且复杂，70.6%（12/17）的腺泡细胞癌显示3+的游离面或/和侧面细胞膜染色，该12例中均可以找到散在的全细胞膜阳性的细胞；88.2%（15/17）腺泡细胞癌出现胞浆染色，但强度较膜染色低，呈1+～2+（封三图5）。即使在同一个肿瘤内，不同的细胞类型和组织学生长类型间染色差异较大，其中以浆液性腺泡细胞染色最为明显，闰管样、实性/小叶状结构类型者相对较弱，空泡样、非特异性腺样者常出现阴性。
7例多形性低度恶性腺癌中有3例（42.9%）可见DOG1阳性，均呈低-中等强度（1+～2+）的部分阳性表达（10%～30%），其染色模式与闰管相类似，为游离面的细胞膜染色，未见胞浆染色，亦未见全细胞膜染色。8例嗜酸细胞肿瘤（包括7例嗜酸细胞腺瘤和1例嗜酸细胞腺癌）及5例非特异性腺癌均阴性。
2.3 DOG1在上皮-肌上皮/基底细胞性涎腺肿瘤中的表达（表1）
37.5%（6/16）的基底细胞腺瘤出现基底细胞成分的细胞浆染色，染色较浅（1+），且均为部分阳性（阳性细胞占10%～30%），其导管上皮成分几乎不染色。85.7%（6/7）的基底细胞腺癌见DOG1染色，其中3例（42.9%）呈弥漫性阳性，阳性率高于基底细胞腺瘤（P=0.0162），其阳性定位于基底细胞胞浆及导管上皮游离面胞膜（封三图6），强度亦略强于基底细胞腺瘤（1+～2+）。
仅在30%（6/20）的腺样囊性癌中观察到DOG1的染色，且分布较为局限，4例表现为局灶区（约10%～20%）肌上皮细胞胞浆1+染色；2例见环绕瘤巢周边的肌上皮细胞胞浆1+染色及导管上皮呈1+～2+游离面胞膜染色，瘤巢中央的肌上皮细胞及导管上皮细胞均阴性。
20例多形性腺瘤中仅5例（25%）出现部分性DOG1阳性，以上皮细胞游离面胞膜阳性为主，呈1+～2+染色强度，仅1例多形性腺瘤出现局灶区肌上皮细胞胞浆1+染色。所有3例上皮-肌上皮癌均未见DOG1染色。
2.4 DOG1在其他涎腺肿瘤中的表达（表1）
大部分黏液表皮样癌DOG1阴性，仅4例（21.1%）出现弱阳性（1+）表达，阳性范围都很局限（5%～20%），阳性部位主要定位于黏液细胞的游离面细胞膜。所有肌上皮瘤、肌上皮癌及Warthin瘤均未见DOG1染色。
3 讨论
DOG1最早于2004年由West[1]等在GIST中首先发现并加以命名，此后研究证实DOG1是一种钙激活的氯离子通道蛋白，其编码基因FLJ10261位于人染色体11q13区，包含26个外显子，编码960个氨基酸，DOG1蛋白约114Kb，是一个具有8个跨膜功能区的膜蛋白。DOG1也被命名为TMEM16A（transmembrane protein 16A）和ANO1（anoctamin 1）[2]。
DOG1在GIST中表达稳定，在90%以上的GIST出现DOG1的表达，其敏感性与特异性均与CD117相似甚至略高，约1/3的CD117阴性的GIST中可检到DOG1表达，其表达与GIST的C-kit基因和PDGFRA基因的突变无关[1，2，7]，因而DOG1最早被作为GIST诊断及鉴别诊断的重要抗体。钙激活的氯离子通道蛋白参与众多的生理过程[2，8]，如上皮细胞电解质和水的分泌、感觉转导、神经和心肌细胞兴奋性调节、血管紧张长度的调节等，且最新研究表明DOG1还与细胞生长、增殖有关[9，10]。DOG1作为钙激活的氯离子通道蛋白，其作用显然不应仅局限于作为GIST的标记物，研究表明DOG1在肝脏、胃粘膜、胆囊、膀胱、乳腺、前列腺、心脏、肺、胎盘和小肠等众多组织中均有表达。在涎腺方面，Yang[2]和Almaca[11]用鼠科动物模型均发现DOG1在涎腺中有表达且可能与涎腺正常分泌有关。Chenevert等发现涎腺组织中存在DOG1 mRNA的扩增，且DOG1在正常涎腺的腺泡细胞、闰管及部分涎腺肿瘤，如腺泡细胞癌、多形性低度恶性腺癌、腺样囊性癌、上皮-肌上皮癌等中有表达。 本组研究显示在正常涎腺中DOG1主要表达于浆液性腺泡，呈腺腔细胞的游离面胞膜及部分侧面胞膜的中等强度染色，显示独特的鹿角状外观；在黏液性腺泡中，DOG1染色强度相对较低，其染色部位与浆液性腺泡相似。从闰管处开始，DOG1表达迅速减少，仅部分闰管呈游离面细胞膜阳性到弱阳性表达，纹状管和导管均未见表达。正常涎腺的肌上皮细胞及基底细胞亦均未见DOG1表达。DOG1这种阳性表达的分布特点与其作为涎腺分泌时的跨膜阴离子通道的功能相符。
在所有涎腺常见肿瘤中，腺泡细胞癌的DOG1表达最强，其染色较之正常浆液性腺泡更强且更加复杂，主要表现为与正常浆液性腺泡相似的游离面胞膜强阳性染色，亦可见鹿角状外观，部分细胞可见全细胞膜染色或出现细胞浆染色，但总体上讲，其阳性特点与正常浆液性腺泡极其相似。这佐证了腺泡细胞癌起源于朝向腺泡细胞分化的闰管细胞或浆液性腺泡细胞[12]，同时，DOG1在腺泡细胞癌中的特征性的强阳性表达有助于腺泡细胞癌的诊断及鉴别诊断。目前腺泡细胞癌尚无特异性抗体，其诊断及鉴别诊断主要依靠形态学特征及特殊染色。典型的腺泡细胞癌在HE切片上呈浆液性腺泡分化，相对容易识别，但部分病例浆液性分化可不明显，此时常需要用消化PAS染色以显示其酶原颗粒。在少数情况下，PAS可不明显乃至阴性，且少数其他涎腺肿瘤也会出现一些胞浆内消化PAS阳性的粘液小滴，这就给腺泡细胞癌的诊断造成了困难，而应用DOG1染色可以将腺泡细胞癌与其易混淆肿瘤区分开来。
腺泡细胞癌除了最常见的浆液性腺泡分化外，还包括腺泡样、闰管样、空泡样、透明样和非特异性腺样等多种细胞类型及实性、小叶状、微囊性和滤泡样等多种组织生长类型，因而需与许多涎腺肿瘤进行鉴别，其中最常见的需要鉴别的是具有上皮分化特征的肿瘤。在这类肿瘤中，DOG1表现出非常好的特异性，所有的嗜酸细胞肿瘤和非特异性腺癌均DOG1阴性，仅少部分多形性低度恶性腺癌和黏液样表皮样癌DOG1阳性，但阳性细胞数较少，强度也明显低于腺泡细胞癌。另外，Warthin瘤极少需要与腺泡细胞癌鉴别，且其DOG1也总是阴性。
其他DOG1表达率较高的涎腺肿瘤为基底细胞肿瘤，在基底细胞腺瘤中DOG1的中阳性率为37.5%，其主要表达于基底细胞成分，呈局灶性的胞浆弱阳性表达，而基底细胞腺癌的总阳性率达85.7%，DOG1表达增强（1+～2+），范围更加广泛，近半数肿瘤出现弥漫阳性表达，阳性表达可见于基底细胞成分和导管上皮成分，其基底细胞呈胞浆染色，而导管上皮成分呈游离面胞膜染色，阳性模式类似于正常的闰管。虽然基底细胞肿瘤DOG1阳性率较高，但其均由导管上皮和基底细胞这两种细胞组成，其器官样生长模式可以通过常规光学显微镜观察到，而且上皮成分和基底细胞成分用S-100、SMA、P63、VIM等抗体染色时可以出现明显的对比，因而基底细胞肿瘤一般不需要借助DOG1与单一细胞的腺泡细胞癌进行鉴别。此外，我们注意到正常涎腺的肌上皮和基底细胞总是呈阴性表达，在基底细胞腺瘤中呈部分弱阳性表达，而在基底细胞腺癌中则呈弥漫的中等强度的阳性表达，这种正常组织、良性肿瘤、恶性肿瘤中DOG1表达递增的现象提示DOG1可能与基底细胞肿瘤的发生、增殖与恶变有关， DOG1可能可以用于基底细胞腺瘤与基底细胞腺癌间的鉴别诊断。
少部分腺样囊性癌和多形性腺瘤可见DOG1阳性，但阳性细胞数少，染色强度较弱，且二者都有较特征的HE形态及上皮-肌上皮双相细胞分化的特征及免疫组化表型，一般也不会对腺泡细胞癌诊断造成困难。本组研究仅收集到3例上皮-肌上皮癌，DOG1均为阴性表达， 与Chenevert报告中约半数的上皮-肌上皮癌表达DOG1的情况不符，其可能是本组研究上皮-肌上皮癌例数过少，抽样误差所致，但不论DOG1阳性与否，含有导管上皮和肌上皮两种细胞的上皮-肌上皮癌较容易通过HE及其他免疫组化抗体检测与腺泡细胞癌鉴别开来，一般无需借助DOG1。另外，所有的由单一肌上皮细胞组成的涎腺肿瘤，包括肌上皮瘤及肌上皮癌均DOG1阴性表达，易与腺泡细胞癌鉴别。
总之，DOG1在腺泡细胞癌中几乎总是呈弥漫强阳性表达，提示DOG1可以与消化PAS联合应用于腺泡细胞癌鉴别及鉴别诊断；基底细胞腺癌中DOG1表达明显高于基底细胞腺瘤，提示DOG1可能可以用于基底细胞腺瘤与基底细胞腺癌的鉴别。
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（收稿日期：2014-09-15）