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摘 要：应用响应面法对青豆复合鸡肉香肠进行工艺优化，通过单因素试验初步确定，以食盐添加量、腌制时间、青豆添加量为自变量，以亚硝酸盐残留量为响应值，进行Box-Behnken试验设计，并构建二次回归方程。结果表明：最佳工艺条件为食盐添加量2.54%、腌制时间36h、青豆添加量10.84%，此时亚硝酸盐残留量最低，香肠整体色泽、口感最佳。
关键词：青豆；复合香肠；响应面分析法；工艺优化
Optimization of Process for the Production of Chicken Sausage with Added Green Soybean by Response Surface Analysis
JU Bin， Batuer ABULIKEMU*， LIU Yana
（College of Food and Pharmaceutics， Xinjiang Agricultural University， ürümqi 830052， China）
Abstract： In this study， we report the optimization of process conditions for the production of chicken sausage with added green soybean using combination of single factor design and response surface methodology. A quadratic regression model equation was developed indicating the effect of salt concentration， curing time and green soybean concentration on nitrate residue using Box-Behnken design. Results showed that 2.54% salt， 36 h curing and 10.84% green soybean were optimum for the minimum level of nitrate residue. Overall， the sausage obtained under these conditions had the best color and taste.
Key words： green soybean； sausage； response surface analysis； process optimization
中图分类号：TS251.51 文献标志码：A 文章编号：1001-8123（2015）04-0026-05
doi： 10.7506/rlyj1001-8123-201504006
随着经济社会的发展，肉类加工的创新形式层出不穷，生产技术和水平都在不断攀升，产品的层次结构、立体性也越来越强，肉类食品已成为了人们生活中必不可少的组成部分，特别是低温肉制品[1-2]。而低温香肠正是其中一类，由于其色泽明亮、食用方便以及最大限度地保持了肌肉的基本结构[3]、营养成分[4]、风味而深受人们青睐。但由于传统香肠脂肪含量较高、营养元素损失较多等[5]问题，导致其市场应用存在较大局限性。而膳食纤维虽然不具有营养价值，但却是健康饮食不可缺少的组成成分，其具有减少胆固醇吸收，降低结肠癌发病几率，促进肠道蠕动[6-8]等优点。将膳食纤维添加到香肠制品中，制成复合香肠，既能改善香肠的感官品质，又能增加香肠本身的营养组分，可改善食品的保健功能，提高出品率、降低成本、增加附加值[9]，提升谷物类资源的转化利用率等[10]。亚硝酸盐主要用于发色以及抑菌，尤其对肉毒梭状芽孢杆菌有良好抑制作用[11]，但亚硝酸盐的过量残留会带来很多危害，例如致畸性、致癌性[12]。因此，在确保色泽、抑菌效果良好的前提下应使其残留量在合理范围内[13]。
复合香肠已有多年的研究，但青豆复合香肠尚未见报道。本实验以鸡肉为主要原料，对青豆复合低温香肠工艺中的食盐添加量、腌制时间、青豆添加量进行优化，以期得到高膳食纤维、低亚硝酸盐残留量的低温复合香肠。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
冻鸡胸肉、青豆、食盐、五香粉、味精、胡椒粉、淀粉、糖、小苏打购自乌鲁木齐爱家超市。
天然羊肠衣 河北省保定市宽泽肠衣厂；复合磷酸盐（食品级） 徐州市天溢源食用化工有限公司；亚硝酸钠（食品级） 杭州市龙山化工有限公司；D-异抗坏血酸钠（食品级） 江西省德兴市百勤异VC钠有限公司；山梨酸钾（食品级） 宁波王龙集团有限公司；亚铁氰化钾、冰乙酸、乙酸钠、硼砂均为分析纯 天津市光复科技发展有限公司。
1.2 仪器与设备
MM8型绞肉机 广东省韶关市大金食品机械厂；
YSN-GC7型灌肠机 广东省广州市优连食品加工机械有限公司；21型可见光分光光度计 上海菁华科技仪器股份有限公司；DHG-9123A型干燥箱 上海一恒科学仪器有限公司；HH-S4水浴锅 金坛市医疗仪器厂；JA2003分析天平 上海上天精密仪器有限公司；PHS-3CpH计 上海仪电科学仪器股份有限公司。
1.3 方法
1.3.1 青豆复合鸡肉香肠工艺流程
青豆→预处理→预煮→晾干
↓
冻鸡胸肉→解冻→绞碎→腌制→制馅→灌制→烘烤→蒸煮→冷却晾干
1.3.2 配方
配方参照文献[14]，并加以改进：鸡肉1kg、食盐2.5%、复合磷酸盐（焦磷酸钠∶六偏磷酸钠∶三聚磷酸钠=2∶2∶1）0.438%、D-异抗坏血酸钠0.109%、亚硝酸钠0.012%、山梨酸钾0.12%、胡椒粉0.15%、味精0.13%、五香粉0.21%、淀粉8.77%、糖3%、青豆12%、冰水13%。 1.3.3 操作要点
1.3.3.1 前处理
鸡胸肉剔除筋膜、脂肪、血块等，将其切成适当大小并匀速通过绞肉机。
1.3.3.2 腌制
将食盐、亚硝酸钠、复合磷酸盐、抗坏血酸钠、山梨酸钾混合均匀后，涂抹于肉表面并适当翻转，确保腌制料涂抹均匀。装盘在4℃条件下腌制24h。
1.3.3.3 拌制
将腌制完全的肉与配料混合均匀，并在拌制过程中不断加入冰水，以控制肉馅温度，防止细菌滋生。拌制前将青豆切碎，以免在香肠中分布不均，拌制时以顺时针方向搅动肉馅[15]。
1.3.3.4 灌制
肠衣在使用前，添加适量小苏打浸泡24h，至肠衣表面呈现白色即可使用。灌制过程中随时检查肠衣情况，保持匀速灌制，以免肠衣受力不均而破裂，同时防止气泡出现，避免局部过紧或过松（以两指按压弹性适度为宜）。
1.3.3.5 烘烤
烘烤前，在其表面使用细牙签扎出肉眼可见小孔，烘烤温度控制在80～85℃，保持香肠中心温度在75℃以上[16]，并在烘烤的过程中不时翻动肠体，使其受热均匀，烘烤时间约1h，直至香肠表面干燥，肠体紧致，并伴有肠衣烤制风味。
1.3.3.6 蒸煮
水烧开后将香肠置于篦子上，放入锅内，进行蒸煮，电磁炉温度恒定于85～90℃，蒸煮30min，选择通风良好处晾干后保藏。
1.3.4 pH值测定
准确称取10 g绞碎后的样品于锥形瓶中，加入100 mL蒸馏水，浸泡约1 h，过滤，用pH计直接测定滤液的pH值[17]。
1.3.5 亚硝酸盐残留量测定[18]
1.3.5.1 标准曲线的绘制
准确吸取0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.50、2.00、2.50 mL亚硝酸钠标准使用液（相当于0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、7.5、10.0、12.5 μg亚硝酸钠），分别置于50 mL带塞比色管中，分别加入2 mL对氨基苯磺酸溶液，混匀，静置3～5 min后各加入1 mL盐酸萘乙二胺溶液，加超纯水至刻度，混匀，静置15 min，在538 nm波长处测定各溶液吸光度，并绘制标准曲线。
1.3.5.2 亚硝酸盐残留量的测定
准确称取样品5.00 g，置于研钵中，加入适量蒸馏水研磨，倒入50 mL烧杯中，加入饱和硼砂12.5 mL，搅拌均匀，用300 mL 70 ℃蒸馏水将试样冲洗进500 mL容量瓶中，100 ℃加热15 min，冷却至室温，加入5 mL亚铁氰化钾，摇匀，再加入5 mL乙酸锌，定容后静置30 min，过滤，取上清液40 mL按标准曲线制作步骤，在相同条件下测定吸光度，并按以下公式进行计算：
式中：X为亚硝酸钠含量/（mg/kg）；m1为样液中亚硝酸钠质量/μg；m为试样质量/g；V1为测定用样液体
积/mL；V0为试样处理液总体积/mL
1.3.6 单因素试验设计
1.3.6.1 食盐添加量对亚硝酸盐残留量的影响
腌制时，腌制时间为24 h，青豆添加量为12%，并分别测定不同食盐添加量1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%对香肠亚硝酸盐残留量的影响。
1.3.6.2 腌制时间对亚硝酸盐残留量的影响
腌制时，食盐添加量为2.5%，青豆添加量为12%，分别测定不同腌制时间12、24、36、48、60、72h，对香肠亚硝酸盐残留量的影响。
1.3.6.3 青豆添加量对亚硝酸盐残留量的影响
腌制时，食盐添加量为2.5%，腌制时间为24h，分别测定不同青豆添加量6%、8%、10%、12%、14%、16%对香肠亚硝酸盐残留量的影响。
1.3.7 响应面试验设计
采用Design-Export 8.0软件根据Box-Behnken Design响应曲面设计进行响应面试验设计，计算分析，并结合单因素试验结果，以食盐添加量、腌制时间以及青豆的添加量为自变量，分别为X1、X2、X3，以亚硝酸盐残留量为因变量Y，进行三因素三水平的响应面试验，试验设计因素编码及水平见表1所示。
2 结果与分析
2.1 亚硝酸盐标准曲线
根据1.3.5.1节的方法进行亚硝酸盐标准曲线的绘制，得到吸光度与亚硝酸盐质量之间的曲线，以亚硝酸钠的质量为横坐标（x）、吸光度为纵坐标（y），亚硝酸盐的标准曲线为y=0.017x+0.004，R2=0.999。
2.2 单因素试验
2.2.1 食盐添加量对亚硝酸盐残留量及pH值的影响
图 1 食盐添加量对亚硝酸盐残留量的影响
Fig.1 Effect of salt concentration on nitrite residue
由图1可知，食盐添加量在1.5%～2.5%时，随着食盐添加量的不断增加，亚硝酸盐残留量迅速降低，由23.66 mg/kg
降低至10.75 mg/kg，降幅达到54.56%，作用十分显著，食盐添加量在2.5%～3.0%之间时，对亚硝酸盐分解的作用开始呈现减缓趋势，但食盐添加量在3.5%时，亚硝酸盐含量又呈现出下降趋势，并在4.0%时呈现大幅度上升。
由表2可知，食盐添加量增高，有助于形成低pH值环境，对亚硝酸盐分解有促进作用，但高浓度的盐也使细胞脱水，阻碍HNO2的复分解反应，表现为亚硝酸盐残留量变化不显著甚至上升，因而继续增大食盐添加量变化不大，所带来的边际效应减弱。考虑到香肠口味上的变化以及口感接受程度，选择食盐添加量为2.5%。 2.2.2 腌制时间对亚硝酸盐残留量的影响
图 2 腌制时间对亚硝酸盐残留量的影响
Fig.2 Effect of curing time on nitrite residue
由图2可知，随着腌制时间的延长，亚硝酸盐残留量整体呈现下降趋势，在开始腌制后的36 h内亚硝酸盐残留量由19.40 mg/kg迅速降低至9.12 mg/kg，降幅达到52.99%，但在随后的12 h内又呈现出小幅的上升趋势，亚硝酸盐残留量为9.40 mg/kg，并且在60 h时小幅降低，72 h时由呈现上升趋势。
由表3可知，随着腌制时间延长，亚硝酸盐不断分解，并在腌制36 h时，分解速率接近最大，而在36～72 h内，由于含盐量不足以长时间抑制细菌生长，蛋白质开始降解，导致部分与蛋白质结合的亚硝盐得到释放，使亚硝酸盐含量异常上升，因此，为保证腌制质量，避免蛋白质发生降解，选择腌制时间为36 h。
2.2.3 青豆添加量对亚硝酸盐残留量的影响
图 3 青豆添加量对亚硝酸盐残留量的影响
Fig.3 Effect of green soybean concentration on nitrite residue
由图3可知，随着青豆添加量的增大，亚硝酸盐残留量呈现出先下降后上升的趋势，青豆添加量在6%～10%时，亚硝酸盐残留量下降趋势十分显著，由14.58 mg/kg
下降至10.25 mg/kg，降幅约30%。而青豆添加量在10%～16%时，亚硝酸盐残留量又迅速回升。
由表4可知，青豆添加量在6%～10%时，pH值较为稳定，并保持在较高水平，这表明，青豆中的有效成分，如VE、碳水化合物等，对亚硝酸盐的分解产生促进作用，但过量添加使得青豆中的硝酸盐成为残留主要来源，并且分解缓慢，因此，选择10%青豆添加量最为适宜。
2.3 响应面设计结果
2.4 回归模型的建立及方差分析
回归方程为：Y=9.4200―0.3786X1―0.1213X2―0.8800X3―0.4575X1X2+0.2450X1X3+0.3250X2X3+1.0138X12+0.4688X22+0.9913X32。
由表6可知，模型的整体显著水平小于0.0001，为极显著水平，并且试验失拟项不显著，表明所选用的二次多项模型有效，试验方法较为可靠，决定系数为97.80%，校正决定系数为94.97%，则说明此模型与实际试验拟合度较好，可用此模型进行结果的预测。
2.5 响应面分析
图 4 食盐添加量和腌制时间对亚硝酸盐残留量的响应面和等高线
Fig.4 Response surface and contour plots showing the effect of salt concentration and curing time on nitrite residue
由图4和表6的方差分析可知，食盐添加量对亚硝酸盐残留量的影响极显著（P<0.01），而腌制时间对亚硝酸盐残留量的影响不显著（P>0.05），食盐添加量和腌制时间对亚硝酸盐残留量的影响极显著（P<0.01）。食盐添加量对亚硝酸盐残留量的影响比腌制时间的影响更为显著。
图 5 食盐添加量和青豆添加量对亚硝酸盐残留量的响应面和等高线
Fig.5 Response surface and contour plots showing the effect of salt and green soybean on nitrite residue
由图5和表6方差分析可知，食盐添加量对亚硝酸盐残留量的影响极显著（P<0.01），而青豆添加量对亚硝酸盐残留量的影响同样极显著（P<0.01），食盐添加量和青豆添加量对亚硝酸盐残留量的影响显著
（P<0.05）。
图 6 腌制时间和青豆添加量对亚硝酸盐残留量的响应面和等高线
Fig.6 Response surface and contour plots showing the effect of curing time and green soybean on nitrite residue
由图6和表6的方差分析可知，响应面图形较为平缓，青豆添加量对亚硝酸盐残留量的影响极显著
（P<0.01），而腌制时间对亚硝酸盐残留量的影响不显著（P>0.05），食盐添加量和腌制时间对亚硝酸盐残留量的影响不显著（P>0.05）。而响应面整体较为陡峭，等高线图则呈现出近椭圆形，表明其交互作用较其他两种情况更为明显，对亚硝酸盐残留量的影响也更为显著。青豆添加量对亚硝酸盐残留量的影响比腌制时间的影响更显著。
2.6 模型的验证
由模型得出青豆香肠的最佳工艺条件为：食盐添加量2.54%、腌制时间36.24 h、青豆添加量10.84%，在此条件下，亚硝酸盐残留量为9.205 2 mg/kg，符合
GB2760—2011《食品添加剂使用标准》关于肉灌肠类食品的残留标准（以亚硝酸盐计，残留量≤30mg/kg）但考虑到实际操作条件，将工艺条件调整为食盐添加量2.54%、腌制时间36 h、青豆添加量10.84%，在此优化条件下进行3 次平行验证实验，得到亚硝酸盐残留量的平均值为9.3217 mg/kg，实际值与预测值之间相对误差为1.27%，在可接受范围内，说明采用此模型优化后得到的残留量在理想范围内，具有实际意义。
3 结 论
本研究通过单因素试验和Box-Behnken响应曲面设计对青豆香肠的制作工艺进行了优化，拟合出以食盐添加量、腌制时间、青豆添加量为自变量，亚硝酸盐残留量为因变量的回归模型，并得到了最终的回归方程：Y=9.420 0―0.378 8X1―0.121 3X2―0.880 0X3―0.457 5X1X2+ 0.245 0X1X3+0.325 0X2X3+1.013 8X12+0.468 8X22+
0.991 3X32，且通过验证实验确保了模型的可靠性。
由模型确定的最佳工艺为食盐添加量2.54%、腌制时间36 h、青豆添加量10.84%，在此条件下得到亚硝酸盐残留量最低，为9.3217 mg/kg。
参考文献：
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关键词：青豆；复合香肠；响应面分析法；工艺优化
Optimization of Process for the Production of Chicken Sausage with Added Green Soybean by Response Surface Analysis
JU Bin， Batuer ABULIKEMU*， LIU Yana
（College of Food and Pharmaceutics， Xinjiang Agricultural University， ürümqi 830052， China）
Abstract： In this study， we report the optimization of process conditions for the production of chicken sausage with added green soybean using combination of single factor design and response surface methodology. A quadratic regression model equation was developed indicating the effect of salt concentration， curing time and green soybean concentration on nitrate residue using Box-Behnken design. Results showed that 2.54% salt， 36 h curing and 10.84% green soybean were optimum for the minimum level of nitrate residue. Overall， the sausage obtained under these conditions had the best color and taste.
Key words： green soybean； sausage； response surface analysis； process optimization
中图分类号：TS251.51 文献标志码：A 文章编号：1001-8123（2015）04-0026-05
doi： 10.7506/rlyj1001-8123-201504006
随着经济社会的发展，肉类加工的创新形式层出不穷，生产技术和水平都在不断攀升，产品的层次结构、立体性也越来越强，肉类食品已成为了人们生活中必不可少的组成部分，特别是低温肉制品[1-2]。而低温香肠正是其中一类，由于其色泽明亮、食用方便以及最大限度地保持了肌肉的基本结构[3]、营养成分[4]、风味而深受人们青睐。但由于传统香肠脂肪含量较高、营养元素损失较多等[5]问题，导致其市场应用存在较大局限性。而膳食纤维虽然不具有营养价值，但却是健康饮食不可缺少的组成成分，其具有减少胆固醇吸收，降低结肠癌发病几率，促进肠道蠕动[6-8]等优点。将膳食纤维添加到香肠制品中，制成复合香肠，既能改善香肠的感官品质，又能增加香肠本身的营养组分，可改善食品的保健功能，提高出品率、降低成本、增加附加值[9]，提升谷物类资源的转化利用率等[10]。亚硝酸盐主要用于发色以及抑菌，尤其对肉毒梭状芽孢杆菌有良好抑制作用[11]，但亚硝酸盐的过量残留会带来很多危害，例如致畸性、致癌性[12]。因此，在确保色泽、抑菌效果良好的前提下应使其残留量在合理范围内[13]。
复合香肠已有多年的研究，但青豆复合香肠尚未见报道。本实验以鸡肉为主要原料，对青豆复合低温香肠工艺中的食盐添加量、腌制时间、青豆添加量进行优化，以期得到高膳食纤维、低亚硝酸盐残留量的低温复合香肠。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
冻鸡胸肉、青豆、食盐、五香粉、味精、胡椒粉、淀粉、糖、小苏打购自乌鲁木齐爱家超市。
天然羊肠衣 河北省保定市宽泽肠衣厂；复合磷酸盐（食品级） 徐州市天溢源食用化工有限公司；亚硝酸钠（食品级） 杭州市龙山化工有限公司；D-异抗坏血酸钠（食品级） 江西省德兴市百勤异VC钠有限公司；山梨酸钾（食品级） 宁波王龙集团有限公司；亚铁氰化钾、冰乙酸、乙酸钠、硼砂均为分析纯 天津市光复科技发展有限公司。
1.2 仪器与设备
MM8型绞肉机 广东省韶关市大金食品机械厂；
YSN-GC7型灌肠机 广东省广州市优连食品加工机械有限公司；21型可见光分光光度计 上海菁华科技仪器股份有限公司；DHG-9123A型干燥箱 上海一恒科学仪器有限公司；HH-S4水浴锅 金坛市医疗仪器厂；JA2003分析天平 上海上天精密仪器有限公司；PHS-3CpH计 上海仪电科学仪器股份有限公司。
1.3 方法
1.3.1 青豆复合鸡肉香肠工艺流程
青豆→预处理→预煮→晾干
↓
冻鸡胸肉→解冻→绞碎→腌制→制馅→灌制→烘烤→蒸煮→冷却晾干
1.3.2 配方
配方参照文献[14]，并加以改进：鸡肉1kg、食盐2.5%、复合磷酸盐（焦磷酸钠∶六偏磷酸钠∶三聚磷酸钠=2∶2∶1）0.438%、D-异抗坏血酸钠0.109%、亚硝酸钠0.012%、山梨酸钾0.12%、胡椒粉0.15%、味精0.13%、五香粉0.21%、淀粉8.77%、糖3%、青豆12%、冰水13%。 1.3.3 操作要点
1.3.3.1 前处理
鸡胸肉剔除筋膜、脂肪、血块等，将其切成适当大小并匀速通过绞肉机。
1.3.3.2 腌制
将食盐、亚硝酸钠、复合磷酸盐、抗坏血酸钠、山梨酸钾混合均匀后，涂抹于肉表面并适当翻转，确保腌制料涂抹均匀。装盘在4℃条件下腌制24h。
1.3.3.3 拌制
将腌制完全的肉与配料混合均匀，并在拌制过程中不断加入冰水，以控制肉馅温度，防止细菌滋生。拌制前将青豆切碎，以免在香肠中分布不均，拌制时以顺时针方向搅动肉馅[15]。
1.3.3.4 灌制
肠衣在使用前，添加适量小苏打浸泡24h，至肠衣表面呈现白色即可使用。灌制过程中随时检查肠衣情况，保持匀速灌制，以免肠衣受力不均而破裂，同时防止气泡出现，避免局部过紧或过松（以两指按压弹性适度为宜）。
1.3.3.5 烘烤
烘烤前，在其表面使用细牙签扎出肉眼可见小孔，烘烤温度控制在80～85℃，保持香肠中心温度在75℃以上[16]，并在烘烤的过程中不时翻动肠体，使其受热均匀，烘烤时间约1h，直至香肠表面干燥，肠体紧致，并伴有肠衣烤制风味。
1.3.3.6 蒸煮
水烧开后将香肠置于篦子上，放入锅内，进行蒸煮，电磁炉温度恒定于85～90℃，蒸煮30min，选择通风良好处晾干后保藏。
1.3.4 pH值测定
准确称取10 g绞碎后的样品于锥形瓶中，加入100 mL蒸馏水，浸泡约1 h，过滤，用pH计直接测定滤液的pH值[17]。
1.3.5 亚硝酸盐残留量测定[18]
1.3.5.1 标准曲线的绘制
准确吸取0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.50、2.00、2.50 mL亚硝酸钠标准使用液（相当于0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、7.5、10.0、12.5 μg亚硝酸钠），分别置于50 mL带塞比色管中，分别加入2 mL对氨基苯磺酸溶液，混匀，静置3～5 min后各加入1 mL盐酸萘乙二胺溶液，加超纯水至刻度，混匀，静置15 min，在538 nm波长处测定各溶液吸光度，并绘制标准曲线。
1.3.5.2 亚硝酸盐残留量的测定
准确称取样品5.00 g，置于研钵中，加入适量蒸馏水研磨，倒入50 mL烧杯中，加入饱和硼砂12.5 mL，搅拌均匀，用300 mL 70 ℃蒸馏水将试样冲洗进500 mL容量瓶中，100 ℃加热15 min，冷却至室温，加入5 mL亚铁氰化钾，摇匀，再加入5 mL乙酸锌，定容后静置30 min，过滤，取上清液40 mL按标准曲线制作步骤，在相同条件下测定吸光度，并按以下公式进行计算：
式中：X为亚硝酸钠含量/（mg/kg）；m1为样液中亚硝酸钠质量/μg；m为试样质量/g；V1为测定用样液体
积/mL；V0为试样处理液总体积/mL
1.3.6 单因素试验设计
1.3.6.1 食盐添加量对亚硝酸盐残留量的影响
腌制时，腌制时间为24 h，青豆添加量为12%，并分别测定不同食盐添加量1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%对香肠亚硝酸盐残留量的影响。
1.3.6.2 腌制时间对亚硝酸盐残留量的影响
腌制时，食盐添加量为2.5%，青豆添加量为12%，分别测定不同腌制时间12、24、36、48、60、72h，对香肠亚硝酸盐残留量的影响。
1.3.6.3 青豆添加量对亚硝酸盐残留量的影响
腌制时，食盐添加量为2.5%，腌制时间为24h，分别测定不同青豆添加量6%、8%、10%、12%、14%、16%对香肠亚硝酸盐残留量的影响。
1.3.7 响应面试验设计
采用Design-Export 8.0软件根据Box-Behnken Design响应曲面设计进行响应面试验设计，计算分析，并结合单因素试验结果，以食盐添加量、腌制时间以及青豆的添加量为自变量，分别为X1、X2、X3，以亚硝酸盐残留量为因变量Y，进行三因素三水平的响应面试验，试验设计因素编码及水平见表1所示。
2 结果与分析
2.1 亚硝酸盐标准曲线
根据1.3.5.1节的方法进行亚硝酸盐标准曲线的绘制，得到吸光度与亚硝酸盐质量之间的曲线，以亚硝酸钠的质量为横坐标（x）、吸光度为纵坐标（y），亚硝酸盐的标准曲线为y=0.017x+0.004，R2=0.999。
2.2 单因素试验
2.2.1 食盐添加量对亚硝酸盐残留量及pH值的影响
图 1 食盐添加量对亚硝酸盐残留量的影响
Fig.1 Effect of salt concentration on nitrite residue
由图1可知，食盐添加量在1.5%～2.5%时，随着食盐添加量的不断增加，亚硝酸盐残留量迅速降低，由23.66 mg/kg
降低至10.75 mg/kg，降幅达到54.56%，作用十分显著，食盐添加量在2.5%～3.0%之间时，对亚硝酸盐分解的作用开始呈现减缓趋势，但食盐添加量在3.5%时，亚硝酸盐含量又呈现出下降趋势，并在4.0%时呈现大幅度上升。
由表2可知，食盐添加量增高，有助于形成低pH值环境，对亚硝酸盐分解有促进作用，但高浓度的盐也使细胞脱水，阻碍HNO2的复分解反应，表现为亚硝酸盐残留量变化不显著甚至上升，因而继续增大食盐添加量变化不大，所带来的边际效应减弱。考虑到香肠口味上的变化以及口感接受程度，选择食盐添加量为2.5%。 2.2.2 腌制时间对亚硝酸盐残留量的影响
图 2 腌制时间对亚硝酸盐残留量的影响
Fig.2 Effect of curing time on nitrite residue
由图2可知，随着腌制时间的延长，亚硝酸盐残留量整体呈现下降趋势，在开始腌制后的36 h内亚硝酸盐残留量由19.40 mg/kg迅速降低至9.12 mg/kg，降幅达到52.99%，但在随后的12 h内又呈现出小幅的上升趋势，亚硝酸盐残留量为9.40 mg/kg，并且在60 h时小幅降低，72 h时由呈现上升趋势。
由表3可知，随着腌制时间延长，亚硝酸盐不断分解，并在腌制36 h时，分解速率接近最大，而在36～72 h内，由于含盐量不足以长时间抑制细菌生长，蛋白质开始降解，导致部分与蛋白质结合的亚硝盐得到释放，使亚硝酸盐含量异常上升，因此，为保证腌制质量，避免蛋白质发生降解，选择腌制时间为36 h。
2.2.3 青豆添加量对亚硝酸盐残留量的影响
图 3 青豆添加量对亚硝酸盐残留量的影响
Fig.3 Effect of green soybean concentration on nitrite residue
由图3可知，随着青豆添加量的增大，亚硝酸盐残留量呈现出先下降后上升的趋势，青豆添加量在6%～10%时，亚硝酸盐残留量下降趋势十分显著，由14.58 mg/kg
下降至10.25 mg/kg，降幅约30%。而青豆添加量在10%～16%时，亚硝酸盐残留量又迅速回升。
由表4可知，青豆添加量在6%～10%时，pH值较为稳定，并保持在较高水平，这表明，青豆中的有效成分，如VE、碳水化合物等，对亚硝酸盐的分解产生促进作用，但过量添加使得青豆中的硝酸盐成为残留主要来源，并且分解缓慢，因此，选择10%青豆添加量最为适宜。
2.3 响应面设计结果
2.4 回归模型的建立及方差分析
回归方程为：Y=9.4200―0.3786X1―0.1213X2―0.8800X3―0.4575X1X2+0.2450X1X3+0.3250X2X3+1.0138X12+0.4688X22+0.9913X32。
由表6可知，模型的整体显著水平小于0.0001，为极显著水平，并且试验失拟项不显著，表明所选用的二次多项模型有效，试验方法较为可靠，决定系数为97.80%，校正决定系数为94.97%，则说明此模型与实际试验拟合度较好，可用此模型进行结果的预测。
2.5 响应面分析
图 4 食盐添加量和腌制时间对亚硝酸盐残留量的响应面和等高线
Fig.4 Response surface and contour plots showing the effect of salt concentration and curing time on nitrite residue
由图4和表6的方差分析可知，食盐添加量对亚硝酸盐残留量的影响极显著（P<0.01），而腌制时间对亚硝酸盐残留量的影响不显著（P>0.05），食盐添加量和腌制时间对亚硝酸盐残留量的影响极显著（P<0.01）。食盐添加量对亚硝酸盐残留量的影响比腌制时间的影响更为显著。
图 5 食盐添加量和青豆添加量对亚硝酸盐残留量的响应面和等高线
Fig.5 Response surface and contour plots showing the effect of salt and green soybean on nitrite residue
由图5和表6方差分析可知，食盐添加量对亚硝酸盐残留量的影响极显著（P<0.01），而青豆添加量对亚硝酸盐残留量的影响同样极显著（P<0.01），食盐添加量和青豆添加量对亚硝酸盐残留量的影响显著
（P<0.05）。
图 6 腌制时间和青豆添加量对亚硝酸盐残留量的响应面和等高线
Fig.6 Response surface and contour plots showing the effect of curing time and green soybean on nitrite residue
由图6和表6的方差分析可知，响应面图形较为平缓，青豆添加量对亚硝酸盐残留量的影响极显著
（P<0.01），而腌制时间对亚硝酸盐残留量的影响不显著（P>0.05），食盐添加量和腌制时间对亚硝酸盐残留量的影响不显著（P>0.05）。而响应面整体较为陡峭，等高线图则呈现出近椭圆形，表明其交互作用较其他两种情况更为明显，对亚硝酸盐残留量的影响也更为显著。青豆添加量对亚硝酸盐残留量的影响比腌制时间的影响更显著。
2.6 模型的验证
由模型得出青豆香肠的最佳工艺条件为：食盐添加量2.54%、腌制时间36.24 h、青豆添加量10.84%，在此条件下，亚硝酸盐残留量为9.205 2 mg/kg，符合
GB2760—2011《食品添加剂使用标准》关于肉灌肠类食品的残留标准（以亚硝酸盐计，残留量≤30mg/kg）但考虑到实际操作条件，将工艺条件调整为食盐添加量2.54%、腌制时间36 h、青豆添加量10.84%，在此优化条件下进行3 次平行验证实验，得到亚硝酸盐残留量的平均值为9.3217 mg/kg，实际值与预测值之间相对误差为1.27%，在可接受范围内，说明采用此模型优化后得到的残留量在理想范围内，具有实际意义。
3 结 论
本研究通过单因素试验和Box-Behnken响应曲面设计对青豆香肠的制作工艺进行了优化，拟合出以食盐添加量、腌制时间、青豆添加量为自变量，亚硝酸盐残留量为因变量的回归模型，并得到了最终的回归方程：Y=9.420 0―0.378 8X1―0.121 3X2―0.880 0X3―0.457 5X1X2+ 0.245 0X1X3+0.325 0X2X3+1.013 8X12+0.468 8X22+
0.991 3X32，且通过验证实验确保了模型的可靠性。
由模型确定的最佳工艺为食盐添加量2.54%、腌制时间36 h、青豆添加量10.84%，在此条件下得到亚硝酸盐残留量最低，为9.3217 mg/kg。
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