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摘 要：该研究以酚菌酮、氯化铜和氨水为主要原料，合成了酚菌酮铜络合物，收率97.6%；采用生长速率法（平皿法）研究酚菌酮铜络合物对苹果斑点落叶病菌生长抑制作用。结果表明，酚菌酮铜络合物对苹果斑点落叶病菌有较高的毒力，使用浓度以400～500mg/L为宜。
关键词：酚菌酮；铜；苹果；斑点落叶病菌
中图分类号 S436.611 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2018）10-0070-02
苹果斑点落叶病又称褐纹病，主要危害叶片，造成早落，也危害新梢和果实，影响树势和产量，而且侵害果实，降低果品质量，在各苹果产区都有发生，成为苹果生产上的重大病害之一。酚菌酮是腾龙公司的专利产品，其用于水稻稻瘟病[1]、纹枯病[2]以及小麦白粉病[3]的防治已有文献发表，但没有用于防治其他病害的报道。铜化合物是重要的农用杀菌剂，无机铜制剂在果树和作物的花期及幼果期使用易产生药害，有机铜制剂杀菌谱广、低残留、污染小、安全可靠，并与环境相容性好、亲和性好，可以与其他作用的农药相混用。目前有机铜制剂主要有：噻菌铜（龙克菌）（20%SC）、喹啉铜、松脂酸铜、壬菌铜、腐殖酸铜等[4]。本研究首次合成了酚菌酮铜络合物，合成路线如图1所示。采用生长速率法对抑制苹果斑点落叶病菌生长进行了试验，旨在为该化合物进一步应用开发提供可靠的依据。
图1 酚菌酮铜络合物合成路线
1 合成实验部分
1.1 仪器与试剂 仪器：Bruker AC-400型核磁共振仪（以CDCl3为溶剂，TMS为内标）；x一4数字显示显微熔点测定仪，温度未校正；液相色谱Agilent 1100。试剂：酚菌酮（江苏腾龙生物药业有限公司技术中心提供），其余试剂市售，氨水（25%～28%）。
1.2 合成工艺 向装有排空冷凝器、温度计、搅拌棒的500mL四口烧瓶中加入氯化铜21.3g（0.125mol）和去离子水250mL，搅拌滴加氨水40g（25%～28%）（0.588mol）控制温度在40℃左右，滴完保温搅拌1h。滴加43.6g95%酚菌酮原油控制温度在50℃以下，同时滴加32%液碱31.3g（0.28mol），滴完保温3h，降温过滤，水洗、烘干得产品47.4g，经液相检测，归一纯度为95%，收率为97.6%（mp：133～135℃）。1H NMR（CDCl3，400MHz）δ：6.71～7.82（m，CH2，苯环），6.383（t，2H，CH2），2.042（m，5H，CH2），1.038（t，2H，CH3）。
2 活性测定部分
2.1 试验靶标 供试病原真菌为苹果斑点落叶病菌（Alternaria alternate f.sp.mali），菌株由南京农业大学杀菌剂实验室提供。
2.2 仪器与试剂 电子天平（感量0.0001g），生物培养箱，蒸汽灭菌锅，干热灭菌烘箱，超净工作台，直径90mm培养皿，移液器，接种针，打孔器（内径6mm），卡尺。N，N-二甲基甲酰胺（DMF）（国药集团），吐温-80（国药集团）。
2.3 培养条件 生物培养箱内（25±1）℃。
2.4 毒力测定方法 参照NY/T1156.2-2006标准推荐的平皿法，步骤如下：（1）病菌准备：室内培养苹果斑点落叶病菌，备用。（2）酚菌酮铜络合物测试浓度药液的配制：先用精密电子天平精确称取酚菌酮铜络合物原药0.2000g 于10mL容量瓶中，用DMF溶解并定容，得20000mg/L的酚菌酮铜络合物溶液，将此溶液用灭菌的0.1%吐温-80水溶液稀释，根据预备试验结果，药剂测定浓度设为15.63、31.25、62.5、125、250、500mg a.i./L，以添加等量0.1%吐温-80水溶液为对照。所有处理重复4次。（3）药剂处理：在无菌条件下，将配制的各处理药液，分别加到预先融化开的PSA培养基中，充分摇匀后，平均倾入4个培养皿中，冷却后制成含药培养基平板，并且以不加药为对照处理。（4）接种与培养：将预先培养好的苹果斑点落叶病菌，在无菌条件下，用直径6mm的打孔器在菌落边缘打取菌丝块。在无菌操作条件下，将菌丝块移入含药培养基平板中央，每皿放1个，菌丝面朝下，盖上皿盖，然后将培养皿倒置放入25℃生物培养箱中培养3d。（5）结果调查：培养结束后，用卡尺测量各处理培养皿中病菌菌落直径（mm），十字形交叉各测量一次，取平均值即为菌落直径（D）。（6）数据处理方法：用Excel计算菌菌生长直径和生长抑制率，公式如下：
生长直径D1=菌落直径D-菌丝块直径D0；
生长抑制率（%）=[对照的生长直径-处理的生长直径对照的生长直径×100]
用DPS6.55软件对药剂的处理浓度与生长抑制率进行回归分析，计算毒力回归方程，求取抑制中浓度（IC50）、抑制生长90%浓度（IC90）及其95%置信限。
2.5 试验结果 测定结果表明，酚菌酮铜络合物的浓度在15.63～500mg/L时，对苹果斑点落叶病菌的生长抑制率达到6.43%～98.57%，用毒力回归方程的方法对药剂浓度与抑制率进行转换、线性回归，得到回归方程如表1所示。从回归方程中，计算得到，酚菌酮铜络合物对苹果斑点落叶病菌菌丝生长的抑制中浓度（IC50）为90.5615mg/L，IC90为316.7680mg/L。
3 结论与讨论
试验结果表明，酚菌酮铜络合物对苹果斑点落叶病菌有較高的毒力，IC50为90.5615mg/L，与段俊飞等报道的药剂活性相比，酚菌酮铜络合物对苹果斑点落叶病菌的活性高于75%百菌清WP（IC50=122.8875mg/L[5]，下同）、65%代森锌WP（124.1855mg/L[5]），明显高于50%醚菌酯WG（743.0596mg/L[5]）和80%多菌灵WP（1665.8480mg/L[5]）。根据本试验结果，酚菌酮铜络合物对苹果斑点落叶病菌菌丝生长抑制率为90%的浓度理论值316.7680mg/L，实际试验中500mg/L的抑制率达到98%以上，因此，在防治苹果斑点落叶病时，建议酚菌酮铜络合物的浓度为400～500mg/L。
参考文献
[1]陈高祥，王太高.40%酚菌酮EW等防治水稻稻瘟病田间药效试验[J].大麦与谷类科学，2010，01：50.
[2]梅桂芳，章玉琴，孟爱中，等.40%酚菌酮水乳剂防治水稻纹枯病田间药效试验初报[J].安徽农学通报，2012，18（04）：69-70.
[3]季文祥，王玉国，皋古西，等.40%酚菌酮水乳剂防治小麦白粉病田间药效试验报告[J].农业开发与装备，2013，06：55，103.
[4]刘艳，王振军.有机铜类化合物杀菌剂的发展现状与展望[J].农业科学通讯，2015，01：177-179.
[5]段俊飞，赵绪生，胡同乐，等.几种杀菌剂对苹果斑点落叶病菌的室内毒力及田间防效[J].中国植保导刊，2012，23（8）：53-57.
（责编：张宏民）
关键词：酚菌酮；铜；苹果；斑点落叶病菌
中图分类号 S436.611 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2018）10-0070-02
苹果斑点落叶病又称褐纹病，主要危害叶片，造成早落，也危害新梢和果实，影响树势和产量，而且侵害果实，降低果品质量，在各苹果产区都有发生，成为苹果生产上的重大病害之一。酚菌酮是腾龙公司的专利产品，其用于水稻稻瘟病[1]、纹枯病[2]以及小麦白粉病[3]的防治已有文献发表，但没有用于防治其他病害的报道。铜化合物是重要的农用杀菌剂，无机铜制剂在果树和作物的花期及幼果期使用易产生药害，有机铜制剂杀菌谱广、低残留、污染小、安全可靠，并与环境相容性好、亲和性好，可以与其他作用的农药相混用。目前有机铜制剂主要有：噻菌铜（龙克菌）（20%SC）、喹啉铜、松脂酸铜、壬菌铜、腐殖酸铜等[4]。本研究首次合成了酚菌酮铜络合物，合成路线如图1所示。采用生长速率法对抑制苹果斑点落叶病菌生长进行了试验，旨在为该化合物进一步应用开发提供可靠的依据。
1 合成实验部分
1.1 仪器与试剂 仪器：Bruker AC-400型核磁共振仪（以CDCl3为溶剂，TMS为内标）；x一4数字显示显微熔点测定仪，温度未校正；液相色谱Agilent 1100。试剂：酚菌酮（江苏腾龙生物药业有限公司技术中心提供），其余试剂市售，氨水（25%～28%）。
1.2 合成工艺 向装有排空冷凝器、温度计、搅拌棒的500mL四口烧瓶中加入氯化铜21.3g（0.125mol）和去离子水250mL，搅拌滴加氨水40g（25%～28%）（0.588mol）控制温度在40℃左右，滴完保温搅拌1h。滴加43.6g95%酚菌酮原油控制温度在50℃以下，同时滴加32%液碱31.3g（0.28mol），滴完保温3h，降温过滤，水洗、烘干得产品47.4g，经液相检测，归一纯度为95%，收率为97.6%（mp：133～135℃）。1H NMR（CDCl3，400MHz）δ：6.71～7.82（m，CH2，苯环），6.383（t，2H，CH2），2.042（m，5H，CH2），1.038（t，2H，CH3）。
2 活性测定部分
2.1 试验靶标 供试病原真菌为苹果斑点落叶病菌（Alternaria alternate f.sp.mali），菌株由南京农业大学杀菌剂实验室提供。
2.2 仪器与试剂 电子天平（感量0.0001g），生物培养箱，蒸汽灭菌锅，干热灭菌烘箱，超净工作台，直径90mm培养皿，移液器，接种针，打孔器（内径6mm），卡尺。N，N-二甲基甲酰胺（DMF）（国药集团），吐温-80（国药集团）。
2.3 培养条件 生物培养箱内（25±1）℃。
2.4 毒力测定方法 参照NY/T1156.2-2006标准推荐的平皿法，步骤如下：（1）病菌准备：室内培养苹果斑点落叶病菌，备用。（2）酚菌酮铜络合物测试浓度药液的配制：先用精密电子天平精确称取酚菌酮铜络合物原药0.2000g 于10mL容量瓶中，用DMF溶解并定容，得20000mg/L的酚菌酮铜络合物溶液，将此溶液用灭菌的0.1%吐温-80水溶液稀释，根据预备试验结果，药剂测定浓度设为15.63、31.25、62.5、125、250、500mg a.i./L，以添加等量0.1%吐温-80水溶液为对照。所有处理重复4次。（3）药剂处理：在无菌条件下，将配制的各处理药液，分别加到预先融化开的PSA培养基中，充分摇匀后，平均倾入4个培养皿中，冷却后制成含药培养基平板，并且以不加药为对照处理。（4）接种与培养：将预先培养好的苹果斑点落叶病菌，在无菌条件下，用直径6mm的打孔器在菌落边缘打取菌丝块。在无菌操作条件下，将菌丝块移入含药培养基平板中央，每皿放1个，菌丝面朝下，盖上皿盖，然后将培养皿倒置放入25℃生物培养箱中培养3d。（5）结果调查：培养结束后，用卡尺测量各处理培养皿中病菌菌落直径（mm），十字形交叉各测量一次，取平均值即为菌落直径（D）。（6）数据处理方法：用Excel计算菌菌生长直径和生长抑制率，公式如下：
生长直径D1=菌落直径D-菌丝块直径D0；
生长抑制率（%）=[对照的生长直径-处理的生长直径对照的生长直径×100]
用DPS6.55软件对药剂的处理浓度与生长抑制率进行回归分析，计算毒力回归方程，求取抑制中浓度（IC50）、抑制生长90%浓度（IC90）及其95%置信限。
2.5 试验结果 测定结果表明，酚菌酮铜络合物的浓度在15.63～500mg/L时，对苹果斑点落叶病菌的生长抑制率达到6.43%～98.57%，用毒力回归方程的方法对药剂浓度与抑制率进行转换、线性回归，得到回归方程如表1所示。从回归方程中，计算得到，酚菌酮铜络合物对苹果斑点落叶病菌菌丝生长的抑制中浓度（IC50）为90.5615mg/L，IC90为316.7680mg/L。
3 结论与讨论
试验结果表明，酚菌酮铜络合物对苹果斑点落叶病菌有較高的毒力，IC50为90.5615mg/L，与段俊飞等报道的药剂活性相比，酚菌酮铜络合物对苹果斑点落叶病菌的活性高于75%百菌清WP（IC50=122.8875mg/L[5]，下同）、65%代森锌WP（124.1855mg/L[5]），明显高于50%醚菌酯WG（743.0596mg/L[5]）和80%多菌灵WP（1665.8480mg/L[5]）。根据本试验结果，酚菌酮铜络合物对苹果斑点落叶病菌菌丝生长抑制率为90%的浓度理论值316.7680mg/L，实际试验中500mg/L的抑制率达到98%以上，因此，在防治苹果斑点落叶病时，建议酚菌酮铜络合物的浓度为400～500mg/L。
参考文献
[1]陈高祥，王太高.40%酚菌酮EW等防治水稻稻瘟病田间药效试验[J].大麦与谷类科学，2010，01：50.
[2]梅桂芳，章玉琴，孟爱中，等.40%酚菌酮水乳剂防治水稻纹枯病田间药效试验初报[J].安徽农学通报，2012，18（04）：69-70.
[3]季文祥，王玉国，皋古西，等.40%酚菌酮水乳剂防治小麦白粉病田间药效试验报告[J].农业开发与装备，2013，06：55，103.
[4]刘艳，王振军.有机铜类化合物杀菌剂的发展现状与展望[J].农业科学通讯，2015，01：177-179.
[5]段俊飞，赵绪生，胡同乐，等.几种杀菌剂对苹果斑点落叶病菌的室内毒力及田间防效[J].中国植保导刊，2012，23（8）：53-57.
（责编：张宏民）