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摘 要：本文首先介绍现有的三代测序技术的内容、方法、原理等；其次，分析和研究了不同测序技术在生育健康、肿瘤诊断与治疗、用药指导等健康医学领域，育种领域及环境保护领域的应用；最后，结合政策红利不断持续及市场需求大幅增加等因素，展望测序技术在未来各领域的应用需求前景广阔。
细胞是生命体最基本的结构单位和功能单位，所有的细胞都含有两种核酸： 即DNA与RNA。核酸是一种大分子化合物，由核苷酸聚合而成，是生命体存在的基础，生命体内的核酸具有易于蛋白质结合的特性，以核蛋白的形式存在。基于化学组成，可将核酸分为核糖核酸和脱氧核糖核酸，即DNA和RNA。DNA主要作为储存、复制和传递遗传信息的介质。RNA又分为tRNA、mRNA和rRNA，其中tRNA，即转运核糖核酸，主要通过携带和转移活化氨基酸的方式，作为核糖核酸的搬运工，促进蛋白质合成。mRNA又称为信使核糖核酸，是蛋白质合成的模板；rRNA，即核糖体的核糖核酸，主要作为蛋白质合成的场所。
快速准确获取细胞中的核酸信息或基因组遗传信息在生命科学研究领域的重要性不言而喻。自上个世纪70年代第一代测序平台的发展、成熟，到如今的第二代高通量测序平台和第三代单分子测序平台快速占领基因测序市场。本文将根据第一、二、三代测序技术的不同发展阶段，结合不同测序技术的实际应用情况，研究不同测序技术在各领域的应用。
一、测序技术简介
（一）第一代测序技术
第一代测序技术以桑格（ Sanger）等的双脱氧测序技术为代表，并引领市场30年。其原理是以DNA单链为模板，通过PCR扩增、电泳分离、激光诱导荧光颜色区分及信息转换等一系列的操作步骤后，获得长度为1000碱基的组成序列。第一代测序技术广泛应用于PCR产物、载体克隆测序等方面，具有读长达1000bp、准确性高达99.99%等特点，但第一代测序技术通量低、成本高的缺点，也限制了其在很多领域的大规模应用，同时也激发了众多科学研究者寻找新一代测序技术的研究浪潮。
（二）第二代测序技术
在市场需求及技术创新的双重推动下，兼具高通量、低成本等优点的第二代测序技术诞生。第二代高通量测序技术为深度测序（deep sequencing）或下一代测序技术（next generation sequencing，NGS）。第二代高通量测序技术的原理是直接通过聚合酶或连接酶的作用，进行体外测序，而无须进行体内扩增。
1、聚合酶合成测序法
目前，行业内从事高通量基因测序的公司，基本均与Illumina公司保持合作关系，采用其Solexa和Hiseq设备。聚合酶合成测序法是以特有的可逆终止化学反应原理为基础，对被随机打断的基因组DNA片段构建文库，经过延伸和扩增，进行边合成边测序。
2、连接酶合成测序法
连接酶合成测序法，即Solid测序，其原理是应用双碱基编码技术，增加碱基被阅读次数，降低测序过程错误比率，便于方便区分SNP和测序错误，并利用DNA连接酶在连接过程之中测序，在测序过程中，仪器自动加入4种荧光标记的寡核苷酸探针，促使其与引物发生连接反应、激发荧光标记的方式，识别碱基类型。
第二代测序技术在保持第一代测序高准确性的同时，大幅提高了测序效率，并降低了测序的成本，但其也存在读长较第一代测序短的不足。
（三）第三代测序技术
第三代测序技术，即单分子测序技术，以SMRT和新型纳米孔测序技术为代表。具有无需PCR扩增、读长较长、CCS模式提高准确率、测序无碱基偏好性，碱基读取无系统偏差，能直接读取碱基修饰等特点。
SMRT测序技术采用荧光标记脱氧核苷酸，用显微镜实时记录荧光的强度变化的方式进行。当被标记的脱氧核苷酸混入DNA链时，DNA链上就能探测到该荧光。当被荧光标记的脱氧核苷酸与DNA链形成化学键时，DNA聚合酶将切除该荧光基团。在此过程中，DNA聚合酶的活性不受荧光标记物影响。因此，荧光基团被切除后，能产生与天然DNA链完全一样的合成的DNA链。
新型纳米孔测序法的实验原理是依据ATCG单个碱基具有的不同带电性质，采用电泳技术，通过信号差异促使不同的单个碱基逐一通过直径非常细小的纳米孔的方式实现测序。
二、测序技术在各领域的应用。
（一）测序技术在健康领域的应用
各种疾病的产生，均与基因序列的异变有着密不可分的关系。基因测序即在分子水平通过对基因序列进行精准测定，从而提供早期筛查和治疗建议的一种生物科技技术。随着科学研究的不断深入，测序技术不断演进，人们对众多基因的结构和功能更加了解，加速了测序技术在生育健康领域（含亲子检测）、肿瘤诊断治疗领域、以高血压、糖尿病为代表的慢病、遗传性疾病、乙肝基因检测等多种疾病的临床用药指导领域内的广泛应用。
1、生育健康领域
市场需求助力测序技术在生育健康领域的应用。一方面，二胎政策放开、高龄产妇数量增加，将大幅增加孕后产前筛查和新生儿疾病检测的需求。另一方面，由于环境污染等各种因素的影响，我国不孕不育率逐年上升，这也将加速试管婴儿胚胎植入前的测序需求。
测序技术可以通过遗传咨询方式，基于测序结果，结合疾病的不同遗传模式进行生育指导。通过孕后产前诊断技术、试管婴儿胚胎植入前筛查等技术，检查胎儿的基因序列，进而判断其健康状况，提高新生宝宝的健康率。无创产前检测（NIPT）是基因测序所应用的产业化程度较高的生育健康市场细分领域。与传统的孕后产前临床检测技术相比，NIPT具有安全性好、准确率高、周期短等优势。
2、肿瘤诊断治疗领域
国家癌症中心2017年公布的我国肿瘤发病率和死亡率的现状和趋势数据显示，目前肺癌、胃癌、肝癌、食管癌和结直肠癌位居我国肿瘤发病前五位。其中，肺癌的高致死性多发生在男性患者群体中，而乳腺癌在女性患者中则高居榜首。目前，C：＼Users＼Administrator＼Desktop＼50019265414022609_？-？？-？？￥？_？μ？è°？？μ？？o？？？？？？ˉ？？¨？？？？？aé￠？？？？？？？？o？？？¨pp＼PaperPass-？？？è？°？？？-？￡？？μ？？？￥？？？＼htmls＼sentence_detail＼75.html肺癌、胃癌、肝癌、食管癌和結直肠癌位居我国肿瘤死亡前五位。综合来看，肺癌居发病率和死因率均居榜首。预防难、发现晚和难治疗是我国肿瘤防控的难点。面对结直肠癌、胃癌、肺癌等肿瘤的发病及死亡率均居前列的严峻形势，结合基因测序具有早期筛查疾病发生、精准定位差异信息并指导精准、安全用药、辅助临床诊断治疗等作用。因此，通过基因测序手段进行癌症的早期筛查、诊断、治疗就显得至关重要。 目前，基于特定突变，通过对血液样本DNA进行分析的方式确定肿瘤存在并能指导干预治疗的液体活检技术备受科学研究者的关注，未来液体活检检查必将像当前市场上的Pap涂片和结肠镜检查一样，成为癌症筛查的重要工具。此外，部分慢病如糖尿病、高血压、心脑血管等疾病的发生与基因表达有着密切的联系，利用基因测序技术能通过连锁分析等手段寻找对应基因、鉴定基因功能等方式，锁定疾病相关基因，确定提前预知疾病发生的风险，并能针对基因差异性情况，提供个性化的预防、诊断、治疗及健康管理方案。
3、用药指导领域
基因检测用于临床用药指导的原理是基于患者体内影响药物代谢的酶的差异，通过基因检测结果，分析其代谢水平，进而了解其对药物反应相关的基因是否存在异变，从而判断其对药物的不良反应程度，辅助医生在药品选择、剂量控制及联合用药等方面提供精准、个性化的用药方案，确保精准用药的同时，降低过度摄入药物的毒副作用。
（二）农业育种领域
高通量测序技术低成本的特性、可拥有参考基因组序列物种的增多、以及全基因组从头测序和深度重测序、分子标记开发、遗传差异及连锁分析、表观遗传和转录组分析等方法的不断推出，为新品种选育、品质改良提供了前所未有的方案，缩短了新品种的育种周期，加速了高通量测序技术在现代农业研究领域的充分应用。在全基因组水平上扫描并检测相关重要位点，对育种领域的研究具有极大的科研与产业价值。
（三）环境保护领域
1、土壤保护领域
土壤微生物种类繁多，约达数万种，在土壤生态系统扮演着举足轻重的角色。通过多种不同代谢方式和生理功能实现的微生物的功能多样性是评价土壤变化原因的重要指示因子。
基于高通量测序技术通量较高的特点，土壤微生物在物种、结构、功能和遗传多样性等领域的研究内容及信息更加丰富。通过高通量测序技术检测土壤中微生物细胞内特定遗传物质的保守序列中可变区域的测定和比对，可分析探究土壤微生物物种和群落结构的多样性特征。
2、污水治理领域
随着我国工业化水平的不断提高，工业废水已成为污水排放比的主要排放源，占我国工业污水排放总量的比例超过1/3以上。同时，由于多数企业无证排污、偷排和超排情况严重，排放量大、达标率低、回用率低是我国污水治理面临的重要现状。
通过基因测序技术，对污水中的菌群的结构和功能进行分析，配合采用生物菌剂及微生态营养制剂作为添加剂等方式，增强有利细胞的代谢强度，加速增殖，促使高效氧化分解毒性污染物，提高系统抗冲击性和稳定性，以较低的运行成本、高效的处理效率、较低的管理难度进行污水治理。
三、展望
政府支持和鼓励以基因测序为基础的精准医疗行业迎来政策红利。2015年，《关于产前诊断机构开展高通量基因测序产前筛查与诊断临床应用试点工作的通知》和《关于开展高通量基因测序技术临床应用试点工作的通知》相继出台，审批通过百余家医疗机构作为高通量基因测序NIPT临床试点单位，从国家层面肯定高通量测序技术在临床检测中的重要作用。2016年，《关于发布国家重点研发计划精准医学研究重点专项2016年度项目申报指南的通知》颁布，将精准医疗列为2016年优先启动的重点专项之一。2017年，地球生物基因组计划（EBP）正式提出，对地球上所有真核生物进行测序。地球物种基因组计划的启动、实施得益于基因测序技术的进步，同时也能推进测序技术的发展，提高技术人员的能力，进而促进基因测序行业的爆发式发展。
政策持续利好、产业潜在需求巨大、测序技术的不断更新将加速基因测序在各个领域的应用推广。利用高通量二代和三代测序技术发现基因的细微差异；利用一代基因测序的精确度，深入探究微生物演进。相信未来，基因测序技术能为人类的健康和疾病预防和治疗和地球的生态平衡等带来质的飞跃。
参考文献：
[1]陈文辉，罗军，赵超.固态纳米孔：下一代DNA测序技术——原理、工艺与挑战[J].中国科学：生命科学，2014，44（7）：649-662.
[2]张得芳，马秋月，尹佟明，夏涛.第三代测序技术及其应用[J].中国生物工程杂志，2013，33（5）：125-131.
[3]任鲁风，于军. 解读生命密码的基本手段——DNA测序技术的前世今生[J].生命科学，2012，24（12）：1357-1362.
[4] Sanger， F. & Nicklen， S. DNA sequencing with chain-terminating.74， 5463–5467 （1977）.
[5]劉国华，叶正芳，吴为中.土壤微生物群落多样性解析法：从培养到非培养[J].生态学报，2012，32（14）：4421-4433.
[6] 姚槐应，黄昌勇.土壤微生物生态学及其实验技术[M].北京：科学出版社，2006：8-8.
细胞是生命体最基本的结构单位和功能单位，所有的细胞都含有两种核酸： 即DNA与RNA。核酸是一种大分子化合物，由核苷酸聚合而成，是生命体存在的基础，生命体内的核酸具有易于蛋白质结合的特性，以核蛋白的形式存在。基于化学组成，可将核酸分为核糖核酸和脱氧核糖核酸，即DNA和RNA。DNA主要作为储存、复制和传递遗传信息的介质。RNA又分为tRNA、mRNA和rRNA，其中tRNA，即转运核糖核酸，主要通过携带和转移活化氨基酸的方式，作为核糖核酸的搬运工，促进蛋白质合成。mRNA又称为信使核糖核酸，是蛋白质合成的模板；rRNA，即核糖体的核糖核酸，主要作为蛋白质合成的场所。
快速准确获取细胞中的核酸信息或基因组遗传信息在生命科学研究领域的重要性不言而喻。自上个世纪70年代第一代测序平台的发展、成熟，到如今的第二代高通量测序平台和第三代单分子测序平台快速占领基因测序市场。本文将根据第一、二、三代测序技术的不同发展阶段，结合不同测序技术的实际应用情况，研究不同测序技术在各领域的应用。
一、测序技术简介
（一）第一代测序技术
第一代测序技术以桑格（ Sanger）等的双脱氧测序技术为代表，并引领市场30年。其原理是以DNA单链为模板，通过PCR扩增、电泳分离、激光诱导荧光颜色区分及信息转换等一系列的操作步骤后，获得长度为1000碱基的组成序列。第一代测序技术广泛应用于PCR产物、载体克隆测序等方面，具有读长达1000bp、准确性高达99.99%等特点，但第一代测序技术通量低、成本高的缺点，也限制了其在很多领域的大规模应用，同时也激发了众多科学研究者寻找新一代测序技术的研究浪潮。
（二）第二代测序技术
在市场需求及技术创新的双重推动下，兼具高通量、低成本等优点的第二代测序技术诞生。第二代高通量测序技术为深度测序（deep sequencing）或下一代测序技术（next generation sequencing，NGS）。第二代高通量测序技术的原理是直接通过聚合酶或连接酶的作用，进行体外测序，而无须进行体内扩增。
1、聚合酶合成测序法
目前，行业内从事高通量基因测序的公司，基本均与Illumina公司保持合作关系，采用其Solexa和Hiseq设备。聚合酶合成测序法是以特有的可逆终止化学反应原理为基础，对被随机打断的基因组DNA片段构建文库，经过延伸和扩增，进行边合成边测序。
2、连接酶合成测序法
连接酶合成测序法，即Solid测序，其原理是应用双碱基编码技术，增加碱基被阅读次数，降低测序过程错误比率，便于方便区分SNP和测序错误，并利用DNA连接酶在连接过程之中测序，在测序过程中，仪器自动加入4种荧光标记的寡核苷酸探针，促使其与引物发生连接反应、激发荧光标记的方式，识别碱基类型。
第二代测序技术在保持第一代测序高准确性的同时，大幅提高了测序效率，并降低了测序的成本，但其也存在读长较第一代测序短的不足。
（三）第三代测序技术
第三代测序技术，即单分子测序技术，以SMRT和新型纳米孔测序技术为代表。具有无需PCR扩增、读长较长、CCS模式提高准确率、测序无碱基偏好性，碱基读取无系统偏差，能直接读取碱基修饰等特点。
SMRT测序技术采用荧光标记脱氧核苷酸，用显微镜实时记录荧光的强度变化的方式进行。当被标记的脱氧核苷酸混入DNA链时，DNA链上就能探测到该荧光。当被荧光标记的脱氧核苷酸与DNA链形成化学键时，DNA聚合酶将切除该荧光基团。在此过程中，DNA聚合酶的活性不受荧光标记物影响。因此，荧光基团被切除后，能产生与天然DNA链完全一样的合成的DNA链。
新型纳米孔测序法的实验原理是依据ATCG单个碱基具有的不同带电性质，采用电泳技术，通过信号差异促使不同的单个碱基逐一通过直径非常细小的纳米孔的方式实现测序。
二、测序技术在各领域的应用。
（一）测序技术在健康领域的应用
各种疾病的产生，均与基因序列的异变有着密不可分的关系。基因测序即在分子水平通过对基因序列进行精准测定，从而提供早期筛查和治疗建议的一种生物科技技术。随着科学研究的不断深入，测序技术不断演进，人们对众多基因的结构和功能更加了解，加速了测序技术在生育健康领域（含亲子检测）、肿瘤诊断治疗领域、以高血压、糖尿病为代表的慢病、遗传性疾病、乙肝基因检测等多种疾病的临床用药指导领域内的广泛应用。
1、生育健康领域
市场需求助力测序技术在生育健康领域的应用。一方面，二胎政策放开、高龄产妇数量增加，将大幅增加孕后产前筛查和新生儿疾病检测的需求。另一方面，由于环境污染等各种因素的影响，我国不孕不育率逐年上升，这也将加速试管婴儿胚胎植入前的测序需求。
测序技术可以通过遗传咨询方式，基于测序结果，结合疾病的不同遗传模式进行生育指导。通过孕后产前诊断技术、试管婴儿胚胎植入前筛查等技术，检查胎儿的基因序列，进而判断其健康状况，提高新生宝宝的健康率。无创产前检测（NIPT）是基因测序所应用的产业化程度较高的生育健康市场细分领域。与传统的孕后产前临床检测技术相比，NIPT具有安全性好、准确率高、周期短等优势。
2、肿瘤诊断治疗领域
国家癌症中心2017年公布的我国肿瘤发病率和死亡率的现状和趋势数据显示，目前肺癌、胃癌、肝癌、食管癌和结直肠癌位居我国肿瘤发病前五位。其中，肺癌的高致死性多发生在男性患者群体中，而乳腺癌在女性患者中则高居榜首。目前，C：＼Users＼Administrator＼Desktop＼50019265414022609_？-？？-？？￥？_？μ？è°？？μ？？o？？？？？？ˉ？？¨？？？？？aé￠？？？？？？？？o？？？¨pp＼PaperPass-？？？è？°？？？-？￡？？μ？？？￥？？？＼htmls＼sentence_detail＼75.html肺癌、胃癌、肝癌、食管癌和結直肠癌位居我国肿瘤死亡前五位。综合来看，肺癌居发病率和死因率均居榜首。预防难、发现晚和难治疗是我国肿瘤防控的难点。面对结直肠癌、胃癌、肺癌等肿瘤的发病及死亡率均居前列的严峻形势，结合基因测序具有早期筛查疾病发生、精准定位差异信息并指导精准、安全用药、辅助临床诊断治疗等作用。因此，通过基因测序手段进行癌症的早期筛查、诊断、治疗就显得至关重要。 目前，基于特定突变，通过对血液样本DNA进行分析的方式确定肿瘤存在并能指导干预治疗的液体活检技术备受科学研究者的关注，未来液体活检检查必将像当前市场上的Pap涂片和结肠镜检查一样，成为癌症筛查的重要工具。此外，部分慢病如糖尿病、高血压、心脑血管等疾病的发生与基因表达有着密切的联系，利用基因测序技术能通过连锁分析等手段寻找对应基因、鉴定基因功能等方式，锁定疾病相关基因，确定提前预知疾病发生的风险，并能针对基因差异性情况，提供个性化的预防、诊断、治疗及健康管理方案。
3、用药指导领域
基因检测用于临床用药指导的原理是基于患者体内影响药物代谢的酶的差异，通过基因检测结果，分析其代谢水平，进而了解其对药物反应相关的基因是否存在异变，从而判断其对药物的不良反应程度，辅助医生在药品选择、剂量控制及联合用药等方面提供精准、个性化的用药方案，确保精准用药的同时，降低过度摄入药物的毒副作用。
（二）农业育种领域
高通量测序技术低成本的特性、可拥有参考基因组序列物种的增多、以及全基因组从头测序和深度重测序、分子标记开发、遗传差异及连锁分析、表观遗传和转录组分析等方法的不断推出，为新品种选育、品质改良提供了前所未有的方案，缩短了新品种的育种周期，加速了高通量测序技术在现代农业研究领域的充分应用。在全基因组水平上扫描并检测相关重要位点，对育种领域的研究具有极大的科研与产业价值。
（三）环境保护领域
1、土壤保护领域
土壤微生物种类繁多，约达数万种，在土壤生态系统扮演着举足轻重的角色。通过多种不同代谢方式和生理功能实现的微生物的功能多样性是评价土壤变化原因的重要指示因子。
基于高通量测序技术通量较高的特点，土壤微生物在物种、结构、功能和遗传多样性等领域的研究内容及信息更加丰富。通过高通量测序技术检测土壤中微生物细胞内特定遗传物质的保守序列中可变区域的测定和比对，可分析探究土壤微生物物种和群落结构的多样性特征。
2、污水治理领域
随着我国工业化水平的不断提高，工业废水已成为污水排放比的主要排放源，占我国工业污水排放总量的比例超过1/3以上。同时，由于多数企业无证排污、偷排和超排情况严重，排放量大、达标率低、回用率低是我国污水治理面临的重要现状。
通过基因测序技术，对污水中的菌群的结构和功能进行分析，配合采用生物菌剂及微生态营养制剂作为添加剂等方式，增强有利细胞的代谢强度，加速增殖，促使高效氧化分解毒性污染物，提高系统抗冲击性和稳定性，以较低的运行成本、高效的处理效率、较低的管理难度进行污水治理。
三、展望
政府支持和鼓励以基因测序为基础的精准医疗行业迎来政策红利。2015年，《关于产前诊断机构开展高通量基因测序产前筛查与诊断临床应用试点工作的通知》和《关于开展高通量基因测序技术临床应用试点工作的通知》相继出台，审批通过百余家医疗机构作为高通量基因测序NIPT临床试点单位，从国家层面肯定高通量测序技术在临床检测中的重要作用。2016年，《关于发布国家重点研发计划精准医学研究重点专项2016年度项目申报指南的通知》颁布，将精准医疗列为2016年优先启动的重点专项之一。2017年，地球生物基因组计划（EBP）正式提出，对地球上所有真核生物进行测序。地球物种基因组计划的启动、实施得益于基因测序技术的进步，同时也能推进测序技术的发展，提高技术人员的能力，进而促进基因测序行业的爆发式发展。
政策持续利好、产业潜在需求巨大、测序技术的不断更新将加速基因测序在各个领域的应用推广。利用高通量二代和三代测序技术发现基因的细微差异；利用一代基因测序的精确度，深入探究微生物演进。相信未来，基因测序技术能为人类的健康和疾病预防和治疗和地球的生态平衡等带来质的飞跃。
参考文献：
[1]陈文辉，罗军，赵超.固态纳米孔：下一代DNA测序技术——原理、工艺与挑战[J].中国科学：生命科学，2014，44（7）：649-662.
[2]张得芳，马秋月，尹佟明，夏涛.第三代测序技术及其应用[J].中国生物工程杂志，2013，33（5）：125-131.
[3]任鲁风，于军. 解读生命密码的基本手段——DNA测序技术的前世今生[J].生命科学，2012，24（12）：1357-1362.
[4] Sanger， F. & Nicklen， S. DNA sequencing with chain-terminating.74， 5463–5467 （1977）.
[5]劉国华，叶正芳，吴为中.土壤微生物群落多样性解析法：从培养到非培养[J].生态学报，2012，32（14）：4421-4433.
[6] 姚槐应，黄昌勇.土壤微生物生态学及其实验技术[M].北京：科学出版社，2006：8-8.