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目的:探究脂联素(APN)基因修饰对内皮祖细胞(EPC)活性的影响及其机制.方法:无菌条件采集3-4周龄SD大鼠胫骨和股骨的骨髓,利用Ficoll-Paque PLUS溶液进行密度梯度离心分离骨髓中的单个核细胞,用EGM-2 Bulletkit培养基定向诱导单个核细胞分化为EPC.通过观察形态、免疫荧光检测细胞表面抗原CD34鉴定EPC.以大鼠EPC细胞的RNA为模板,PCR扩增出携带NheⅠ、XmaⅠ酶切位点的大鼠APN基因,重组到pLKIRG载体中,得到pLKIRG-APN载体,通过NheⅠ、XmaⅠ双酶切检测和Sanger法测序鉴定pLKIRG-APN慢病毒真核表达载体.pLKIRG-APN和pLKIRG分别与慢病毒包装质粒瞬转293T细胞,分别获得对照慢病毒(LV-NC)和过表达APN慢病毒(LV-APN),利用qPCR Lentivirus Titration Kit检测慢病毒滴度.LV-NC和LV-APN分分别感染EPC细胞48 h,0.1μg/μl嘌呤霉素连续筛选3 d,分别收集LV-APN感染组细胞(EPC-APN)和LV-NC感染组细胞(EPC-NC).分别通过qPCR和WB检测APN的mRNA和蛋白表达水平.利用CCK8和Transwell分别检测EPC-APN和EPC-NC细胞的增殖和迁移能力,qPCR检测EPC-APN和EPC-NC细胞中VEGF、eNOS基因mRNA表达水平,WB检测VEGF、磷酸化VEGFR2、eNOS和Ser1177位点磷酸化eNOS的丰度.结果:大鼠单个核细胞最初为悬浮状态,第3天开始细胞逐渐贴壁,随后出现细胞集落,第7天细胞呈梭形或者多边形,第14天细胞呈现铺路石样生长状态.免疫荧光检测结果显示诱导培养2周后EPC的CD34阳性率达到90％以上.利用PCR扩增出大鼠APN基因,成功地构建了pLKIRG-APN慢病毒真核表达载体.qPCR和WB结果表明EPC-APN组APN的mRNA和蛋白表达水平较EPC-NC组明显升高,表明成功构建了过表达APN细胞.细胞功能试验显示EPC-APN的增殖和迁移能力与EPC-NC相比显著增强.EPC-APN中VEGF和eNOS基因的表达水平以及磷酸化VEGFR2和Ser1177位点磷酸化eNOS蛋白丰度明显高于EPC-NC.结论:APN基因修饰很可能通过促进VEGF、eNOS表达以及eNOS活化增强EPC的增殖和迁移能力,为利用APN修饰的EPC治疗血管损伤性疾病和缺血性疾病提供了理论依据.