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摘 要：目的：了解神经干细胞诱导分化所得胆碱能神经元和运动神经元中Hoxa9基因与音猬因子（Shh）的差异表达情况，探讨它们在神经干细胞定向分化过程中的作用。方法：采用实时定量PCR技术，观察Hoxa9基因与音猬因子在胆碱能神经元和运动神经元中的表达情况。结果：Hoxa9在胆碱能神经元中的表达是在运动神经元中的0.169倍（P<0.05）。Shh只在运动神经元中有表达。结论：Hoxa9与Shh在运动神经元和胆碱能神经元之间的表达差异是由于分化时段的不同所导致的。二者在神经干细胞向运动神经元的分化过程中都起着重要的作用。
关键词：运动神经元；胆碱能神经元；神经干细胞；Hoxa9基因；音猬因子（Shh）；脊髓损伤；运动损伤
中图分类号：G804.2 文献标志码：A 文章编号：1007-3612（2012）11-0058-03
The Effects of Hoxa9 and Shh on Oriented Differentiation of the Neural Stem Cells
HU Qikai1， WANG Chunfang2
（1. P.E. College，Shanxi Traditional Chinese Medicine University， Taiyuan 030024， Shanxi China；2. Experimental Animal center， Shanxi Medical University， Taiyuan 030001， Shanxi China）
Abstract：Objective： To study the differential expression and effect of Hox gene and Shh between the cholinergic neurons and motor neurons which differentiated from neural stem cells. Methods： Use the ABI’s TaqMan MicroRNA Assays realtime PCR to observe the expression of Hox gene and Shh in cholinergic neurons and motor neurons. Results： The level of Hoxa9 in cholinergic neurons was 0.169 fold of that in motor neurons （P<0.05）， and Shh expressed in motor neurons， but wasn’t detected in cholinergic neurons. Conclusion： The differential expression of Hoxa9 and Shh was resulted by differentiation of the different time in motor neurons and cholinergic neurons. Both Hoxa9 and Shh play an important role in differentiation from neural stem cells to motor neurons.
Key words： motor neurons； cholinergic neurons； neural stem cells； homeoboxgenes （Hoxa9）； sonic hedgehog（Shh）； spinal cord injury； sports injury
脊髓损伤是由于多种原因引起脊髓结构及功能的损害，是一种严重的致残性损伤。据统计，我国脊髓损伤的病因依次为高空坠落、车祸和重物砸伤等，而运动创伤所致的脊髓损伤也屡见不鲜。在一些体育比赛中，例如跳水，摔跤等，当外来的巨大暴力作用于运动员脊柱时将导致脊柱骨折或者脱位，使脊柱失去了对脊髓的保护作用，甚至脊柱骨折脱位后造成脊髓压迫，导致脊髓功能损伤。脊髓损伤发生后，损伤部位的神经轴突被撕裂，运动神经元（Motor neurons， MNs）和神经胶质细胞死亡，幸存的轴突发生脱髓鞘改变，最终导致脊髓丧失传导下行的运动冲动和上行的感觉冲动的能力而发生截瘫。长期以来对于脊髓损伤，包括运动性脊髓损伤的治疗一直是一个难题。神经干细胞（Neural stem cells， NSCs）的发现，为脊髓损伤开拓了新天地，为其治疗和修复受损的脊髓运动神经元，提供了新的治疗途径［1-2］。但目前对于神经干细胞向运动神经元诱导分化的研究仅局限于比较诱导分化后所得细胞与神经干细胞在某些标志基因上的差别，但这无法确定诱导所得细胞就是我们的目的细胞。Hoxa9基因（homeobox genes）与音猬因子（sonic hedgehog ， Shh）是MNs在体内发育的关键因子，且它们之间又存在着相互调控的关系，就此，我们在前期研究的基础上，采用实时定量PCR技术，观察Hoxa9基因与音猬因子在NSCs诱导分化所得胆碱能神经元（可以分泌乙酰胆碱的神经元，标志基因为胆碱乙酰转移酶（ChAT），运动神经元为胆碱能神经元中的一种）和MNs中的表达情况，探讨它们在NSCs定向分化过程中的作用。
1 材料和方法
1.1 材料 清洁级Wistar孕鼠（购自山西医科大学实验动物中心）。CELLectionTM Pan Mouse IgG Kit（Dyna1），磁力架Dynal MPCTML （Dynal），小鼠抗大鼠NGFR的单克隆抗体（192-IgG，Chemicon），DMEM （Gibco），胎牛血清（杭州四季青），兔抗大鼠胆碱乙酰转移酶（ChAT）抗体（武汉博士德），FITC标记的羊抗兔抗体（武汉博士德）。PCR仪 （ABI公司TaqMan MicroRNA Assays realtime），RNAprep pure动物组织总RNA提取试剂盒（天根生化 DP431），cDNA第一链合成试剂盒（天根生化 KR103-03），RealMasterMix（天根生化 FP202-01） 1.2 方法
1.2.1 胆碱能神经元和MNs的体外分离和纯化 选取健康孕龄17 d的Wistar大鼠（由山西医科大学实验动物中心提供），按本室前期的纯化方法，我们用免疫磁珠法分离获得运动神经元，并从剩余的细胞中培养获得神经干细胞。并按照本室前期的诱导分化方法将神经干细胞诱导分化为胆碱能神经元［3-4］。分别收集诱导后所获得的胆碱能神经元和MNs。
1.2.2 实时定量PCR法 采用实时定量PCR法对胆碱能神经元和MNs中Hoxa9和Shh mRNA的表达进行相对定量分析，内参为18sRNA。方法如下：
1.2.2.1 总RNA提取 提取胆碱能神经元和MNs的总RNA，方法按RNAprep pure动物组织总RNA提取试剂盒说明操作。
1.2.2.2 逆转录 1）在DEPC处理过的Ep管中配制下列模板RNA/引物混合液（表1）；2）70℃保温10 min后迅速在冰上急冷2 min以上；3）离心数秒钟使模板RNA/引物的变性溶液聚集于Ep管底部；4）在上述Ep管中配制下列逆转录反应液（表2）；5）42℃反应1 h；6）70℃保温15 min后冰上冷却，将所得cDNA于-20℃保存备用。
1.3 实时定量PCR 应用Primer Express 3.0软件设计18SrRNA， Shh和Hoxa9的实时定量PCR引物，引物序列见表3。
按以下列条件进行扩增（表4）：95℃ 10 min，95℃ 15 s，60℃ 1 min，循环40次。反应设置4个复孔，以18SrRNA作为内对照。采用比较CT值法，应用RQ Study 软件（Applied Biosystems）进行miRNAs的相对定量分析。
2 研究结果
在MNs和NSCs诱导分化所得胆碱能神经元Hoxa9和Shh表达情况的比较中，我们发现Hoxa9在胆碱能神经元中的表达是在MNs中的0.169倍（P<0.05）。Shh在MNs中有表达，而在胆碱能神经元中用实时定量PCR无法检测到（图1）。
图1 Hoxa9和Shh在SCSCs诱导分化所得胆碱能神经元和MNs中的表达情况。
3 分析与讨论
脊髓损伤是一种以损伤平面以下感觉、运动功能完全丧失和尿便失禁为主要临床表现的中枢神经系统的严重创伤性疾病，也是造成截瘫的主要原因和人类致残率最高的疾患之一。NSCs的发现为脊髓损伤的移植治疗提供了新的希望。Shh和（全反式维甲酸）RA是MNs在体内发育的关键因子，Wichterle［5］等通过模拟体内MNs分化的途径，在体外用Shh和RA诱导鼠胚胎干细胞先向脊髓祖细胞分化，进而诱导脊髓祖细胞向MNs分化，最终20%～30%的细胞表达MNs的标记物Hb9。此后几年中，也有实验室得出类似的实验结果［6-7］。近年来，本课题组联合应用Shh和RA，诱导脊髓干细胞（SCSCs），所得的细胞表达ChAT［8］（ChAT是MNs的重要标记之一）。但仅局限于比较诱导分化后所得细胞与NSCs在某些标志基因上的差别，是无法确定诱导所得细胞就是我们的目的细胞，因此需要对NSCs向MNs的诱导分化过程进行详细的了解。
由于Hox与Shh是MNs在体内发育的关键因子，且它们之间又存在着相互调控的关系［9］。因此，我们在实验中观察了Hoxa9与Shh在NSCs诱导分化所得的胆碱能神经元与MNs之间表达的差别。结果显示，Hoxa9在MNs与神经干细胞诱导所得的胆碱能神经元中表达水平不同，在MNs中较胆碱能神经元中表达高。由于MNs是获取至孕17 d大鼠，在此阶段，MNs处于发育过程中，而胆碱能神经元是获取至神经干细胞诱导分化后14 d，此阶段，胆碱能神经元已经发育成熟。因为Hox基因家族在MNs的发育过程中起作用，对MNs的亚型的确定也起着重要作用。因此，我们认为Hoxa9在MNs和胆碱能神经元之间的表达差异是由于分化时段的不同所导致的。另外，由于Hox与Shh之间存在着调控关系，所以Shh的表达与Hox的表达情况相同。因此，我们认为，无论是体内发育还是体外诱导分化，Hox与Shh在NSCs向MNs的分化过程中都起着重要的作用，对于对NSCs向MNs的诱导分化过程还需要进一步的了解。
在研究过程中我们认识到，发生在运动员中的脊髓损伤与运动训练相关，而运动训练和运动损伤是一对矛盾，运动损伤有自身的客观规律，在运动损伤中以急性运动损伤为主。要建立在科学训练基础上，循序渐进，纠正违背人体生理结构的错误动作［10］。脊髓损伤后的神经干细胞修复只是一种补救手段。低水平风险认知将显著增加锻炼者的受伤风险， 是引发运动损伤的重要心理危险因素； 相反， 对减少受伤风险的相关因素而言， 高水平的风险认知无疑可作为保护锻炼者避免运动损伤的安全因素［11］。今后对各级运动员要坚决贯彻科学训练，同时，深入进行如脊髓损伤这类运动损伤的修复研究，为运动员提供保障。
参考文献：
［1］ Louro J， Pearse DD. Stem and progenitor cell therapies： recent progress for spinal cord injury repair［J］. Neurol Res，2008，30（1）： 5-16.
［2］ Wrathall JR， Lytle JM. Stem cells in spinal cord injury［J］. Dis Markers，2008，24（4-5）： 239-250.
［3］ 王菲，王春芳，李鹏飞，等.免疫磁珠法分离纯化胚胎大鼠脊髓源运动神经元的方法探讨［J］. 中国组织化学与细胞化学杂志，2009，18（4）：422-425.
［4］ Hongen Wei， Chunfang Wang， Chuansen Zhang， et al.Comparative profiling of microRNA expression between neural stem cells and motor neurons in embryonic spinal cord in rat［J］. International Journal of Developmental Neuroscience， 2010，28（6）：545-551. ［5］ Wichterle H， Lieberam I， Porter JA， et al.Directed differentiation of embryonic stem cells into motor neurons［J］. Cell， 2002， 110（3）： 385-397.
［6］ Singh Roy N， Nakano T， Xuing L， et al.Enhancerspecified GFPbased FACS purification of human spinal motor neurons from embryonic stem cells［J］. Exp Neurol， 2005， 196（2）： 224-234.
［7］ Li XJ， Du ZW， Zarnowska ED， et al.Specification of motoneurons from human embryonic stem cells［J］. Nat Biotechnol， 2005，23（2）：215-221.
［8］ 李鹏飞，王春芳.胚胎大鼠脊髓神经干细胞体外培养与定向分化为胆碱能神经元的研究［J］.神经解剖学杂志， 2007， 23（6）： 621-625.
［9］ Tarchini B， Duboule D， Kmita M. Regulatory constraints in the evolution of the tetrapod limb anteriorposterior polarity［J］. Nature， 2006， 443（7114）：985-988.
［10］邓非.初探警校学员运动损伤现状与对策［J］.湖南警察学院学报，2011，23（6）：140-144.
［11］陈金鳌，陆彩凤，王欣.健身锻炼心理预测因素与运动损伤的相关性研究［J］.体育科学，2011，31（11）：27-34.
关键词：运动神经元；胆碱能神经元；神经干细胞；Hoxa9基因；音猬因子（Shh）；脊髓损伤；运动损伤
中图分类号：G804.2 文献标志码：A 文章编号：1007-3612（2012）11-0058-03
The Effects of Hoxa9 and Shh on Oriented Differentiation of the Neural Stem Cells
HU Qikai1， WANG Chunfang2
（1. P.E. College，Shanxi Traditional Chinese Medicine University， Taiyuan 030024， Shanxi China；2. Experimental Animal center， Shanxi Medical University， Taiyuan 030001， Shanxi China）
Abstract：Objective： To study the differential expression and effect of Hox gene and Shh between the cholinergic neurons and motor neurons which differentiated from neural stem cells. Methods： Use the ABI’s TaqMan MicroRNA Assays realtime PCR to observe the expression of Hox gene and Shh in cholinergic neurons and motor neurons. Results： The level of Hoxa9 in cholinergic neurons was 0.169 fold of that in motor neurons （P<0.05）， and Shh expressed in motor neurons， but wasn’t detected in cholinergic neurons. Conclusion： The differential expression of Hoxa9 and Shh was resulted by differentiation of the different time in motor neurons and cholinergic neurons. Both Hoxa9 and Shh play an important role in differentiation from neural stem cells to motor neurons.
Key words： motor neurons； cholinergic neurons； neural stem cells； homeoboxgenes （Hoxa9）； sonic hedgehog（Shh）； spinal cord injury； sports injury
脊髓损伤是由于多种原因引起脊髓结构及功能的损害，是一种严重的致残性损伤。据统计，我国脊髓损伤的病因依次为高空坠落、车祸和重物砸伤等，而运动创伤所致的脊髓损伤也屡见不鲜。在一些体育比赛中，例如跳水，摔跤等，当外来的巨大暴力作用于运动员脊柱时将导致脊柱骨折或者脱位，使脊柱失去了对脊髓的保护作用，甚至脊柱骨折脱位后造成脊髓压迫，导致脊髓功能损伤。脊髓损伤发生后，损伤部位的神经轴突被撕裂，运动神经元（Motor neurons， MNs）和神经胶质细胞死亡，幸存的轴突发生脱髓鞘改变，最终导致脊髓丧失传导下行的运动冲动和上行的感觉冲动的能力而发生截瘫。长期以来对于脊髓损伤，包括运动性脊髓损伤的治疗一直是一个难题。神经干细胞（Neural stem cells， NSCs）的发现，为脊髓损伤开拓了新天地，为其治疗和修复受损的脊髓运动神经元，提供了新的治疗途径［1-2］。但目前对于神经干细胞向运动神经元诱导分化的研究仅局限于比较诱导分化后所得细胞与神经干细胞在某些标志基因上的差别，但这无法确定诱导所得细胞就是我们的目的细胞。Hoxa9基因（homeobox genes）与音猬因子（sonic hedgehog ， Shh）是MNs在体内发育的关键因子，且它们之间又存在着相互调控的关系，就此，我们在前期研究的基础上，采用实时定量PCR技术，观察Hoxa9基因与音猬因子在NSCs诱导分化所得胆碱能神经元（可以分泌乙酰胆碱的神经元，标志基因为胆碱乙酰转移酶（ChAT），运动神经元为胆碱能神经元中的一种）和MNs中的表达情况，探讨它们在NSCs定向分化过程中的作用。
1 材料和方法
1.1 材料 清洁级Wistar孕鼠（购自山西医科大学实验动物中心）。CELLectionTM Pan Mouse IgG Kit（Dyna1），磁力架Dynal MPCTML （Dynal），小鼠抗大鼠NGFR的单克隆抗体（192-IgG，Chemicon），DMEM （Gibco），胎牛血清（杭州四季青），兔抗大鼠胆碱乙酰转移酶（ChAT）抗体（武汉博士德），FITC标记的羊抗兔抗体（武汉博士德）。PCR仪 （ABI公司TaqMan MicroRNA Assays realtime），RNAprep pure动物组织总RNA提取试剂盒（天根生化 DP431），cDNA第一链合成试剂盒（天根生化 KR103-03），RealMasterMix（天根生化 FP202-01） 1.2 方法
1.2.1 胆碱能神经元和MNs的体外分离和纯化 选取健康孕龄17 d的Wistar大鼠（由山西医科大学实验动物中心提供），按本室前期的纯化方法，我们用免疫磁珠法分离获得运动神经元，并从剩余的细胞中培养获得神经干细胞。并按照本室前期的诱导分化方法将神经干细胞诱导分化为胆碱能神经元［3-4］。分别收集诱导后所获得的胆碱能神经元和MNs。
1.2.2 实时定量PCR法 采用实时定量PCR法对胆碱能神经元和MNs中Hoxa9和Shh mRNA的表达进行相对定量分析，内参为18sRNA。方法如下：
1.2.2.1 总RNA提取 提取胆碱能神经元和MNs的总RNA，方法按RNAprep pure动物组织总RNA提取试剂盒说明操作。
1.2.2.2 逆转录 1）在DEPC处理过的Ep管中配制下列模板RNA/引物混合液（表1）；2）70℃保温10 min后迅速在冰上急冷2 min以上；3）离心数秒钟使模板RNA/引物的变性溶液聚集于Ep管底部；4）在上述Ep管中配制下列逆转录反应液（表2）；5）42℃反应1 h；6）70℃保温15 min后冰上冷却，将所得cDNA于-20℃保存备用。
1.3 实时定量PCR 应用Primer Express 3.0软件设计18SrRNA， Shh和Hoxa9的实时定量PCR引物，引物序列见表3。
按以下列条件进行扩增（表4）：95℃ 10 min，95℃ 15 s，60℃ 1 min，循环40次。反应设置4个复孔，以18SrRNA作为内对照。采用比较CT值法，应用RQ Study 软件（Applied Biosystems）进行miRNAs的相对定量分析。
2 研究结果
在MNs和NSCs诱导分化所得胆碱能神经元Hoxa9和Shh表达情况的比较中，我们发现Hoxa9在胆碱能神经元中的表达是在MNs中的0.169倍（P<0.05）。Shh在MNs中有表达，而在胆碱能神经元中用实时定量PCR无法检测到（图1）。
图1 Hoxa9和Shh在SCSCs诱导分化所得胆碱能神经元和MNs中的表达情况。
3 分析与讨论
脊髓损伤是一种以损伤平面以下感觉、运动功能完全丧失和尿便失禁为主要临床表现的中枢神经系统的严重创伤性疾病，也是造成截瘫的主要原因和人类致残率最高的疾患之一。NSCs的发现为脊髓损伤的移植治疗提供了新的希望。Shh和（全反式维甲酸）RA是MNs在体内发育的关键因子，Wichterle［5］等通过模拟体内MNs分化的途径，在体外用Shh和RA诱导鼠胚胎干细胞先向脊髓祖细胞分化，进而诱导脊髓祖细胞向MNs分化，最终20%～30%的细胞表达MNs的标记物Hb9。此后几年中，也有实验室得出类似的实验结果［6-7］。近年来，本课题组联合应用Shh和RA，诱导脊髓干细胞（SCSCs），所得的细胞表达ChAT［8］（ChAT是MNs的重要标记之一）。但仅局限于比较诱导分化后所得细胞与NSCs在某些标志基因上的差别，是无法确定诱导所得细胞就是我们的目的细胞，因此需要对NSCs向MNs的诱导分化过程进行详细的了解。
由于Hox与Shh是MNs在体内发育的关键因子，且它们之间又存在着相互调控的关系［9］。因此，我们在实验中观察了Hoxa9与Shh在NSCs诱导分化所得的胆碱能神经元与MNs之间表达的差别。结果显示，Hoxa9在MNs与神经干细胞诱导所得的胆碱能神经元中表达水平不同，在MNs中较胆碱能神经元中表达高。由于MNs是获取至孕17 d大鼠，在此阶段，MNs处于发育过程中，而胆碱能神经元是获取至神经干细胞诱导分化后14 d，此阶段，胆碱能神经元已经发育成熟。因为Hox基因家族在MNs的发育过程中起作用，对MNs的亚型的确定也起着重要作用。因此，我们认为Hoxa9在MNs和胆碱能神经元之间的表达差异是由于分化时段的不同所导致的。另外，由于Hox与Shh之间存在着调控关系，所以Shh的表达与Hox的表达情况相同。因此，我们认为，无论是体内发育还是体外诱导分化，Hox与Shh在NSCs向MNs的分化过程中都起着重要的作用，对于对NSCs向MNs的诱导分化过程还需要进一步的了解。
在研究过程中我们认识到，发生在运动员中的脊髓损伤与运动训练相关，而运动训练和运动损伤是一对矛盾，运动损伤有自身的客观规律，在运动损伤中以急性运动损伤为主。要建立在科学训练基础上，循序渐进，纠正违背人体生理结构的错误动作［10］。脊髓损伤后的神经干细胞修复只是一种补救手段。低水平风险认知将显著增加锻炼者的受伤风险， 是引发运动损伤的重要心理危险因素； 相反， 对减少受伤风险的相关因素而言， 高水平的风险认知无疑可作为保护锻炼者避免运动损伤的安全因素［11］。今后对各级运动员要坚决贯彻科学训练，同时，深入进行如脊髓损伤这类运动损伤的修复研究，为运动员提供保障。
参考文献：
［1］ Louro J， Pearse DD. Stem and progenitor cell therapies： recent progress for spinal cord injury repair［J］. Neurol Res，2008，30（1）： 5-16.
［2］ Wrathall JR， Lytle JM. Stem cells in spinal cord injury［J］. Dis Markers，2008，24（4-5）： 239-250.
［3］ 王菲，王春芳，李鹏飞，等.免疫磁珠法分离纯化胚胎大鼠脊髓源运动神经元的方法探讨［J］. 中国组织化学与细胞化学杂志，2009，18（4）：422-425.
［4］ Hongen Wei， Chunfang Wang， Chuansen Zhang， et al.Comparative profiling of microRNA expression between neural stem cells and motor neurons in embryonic spinal cord in rat［J］. International Journal of Developmental Neuroscience， 2010，28（6）：545-551. ［5］ Wichterle H， Lieberam I， Porter JA， et al.Directed differentiation of embryonic stem cells into motor neurons［J］. Cell， 2002， 110（3）： 385-397.
［6］ Singh Roy N， Nakano T， Xuing L， et al.Enhancerspecified GFPbased FACS purification of human spinal motor neurons from embryonic stem cells［J］. Exp Neurol， 2005， 196（2）： 224-234.
［7］ Li XJ， Du ZW， Zarnowska ED， et al.Specification of motoneurons from human embryonic stem cells［J］. Nat Biotechnol， 2005，23（2）：215-221.
［8］ 李鹏飞，王春芳.胚胎大鼠脊髓神经干细胞体外培养与定向分化为胆碱能神经元的研究［J］.神经解剖学杂志， 2007， 23（6）： 621-625.
［9］ Tarchini B， Duboule D， Kmita M. Regulatory constraints in the evolution of the tetrapod limb anteriorposterior polarity［J］. Nature， 2006， 443（7114）：985-988.
［10］邓非.初探警校学员运动损伤现状与对策［J］.湖南警察学院学报，2011，23（6）：140-144.
［11］陈金鳌，陆彩凤，王欣.健身锻炼心理预测因素与运动损伤的相关性研究［J］.体育科学，2011，31（11）：27-34.