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摘要： 为了探索人参根、叶片总RNA的提取方法，以多年生人参根、叶片为材料，比较7种提取方法的总RNA质量。结果表明：除改良CTAB法对人参根总RNA的提取效果不明显，其余方法均能从人参根、叶片中提取、分离到总RNA，其中 RNAPure 高纯总 RNA 快速提取试剂盒法能提取到完整性较好、纯度较高的总RNA，琼脂糖凝胶电泳显示的条带清晰完整，根中RNA的D260 nm/D280 nm为1.87，RNA浓度为351.8 ng/μL；用Reverse Transcriptase M-MLV（RNase H-）试剂盒、PrimeScript Reverse Transcriptase试剂盒、GoScript TM Reverse Transcription System试剂盒对提取的总RNA进行反转录，其中用GoScript TM Reverse Transcription System试剂盒反转录后进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳条带较亮，证明转录效果较好。经反转录、PCR证明，提取的总RNA适用于后续的分子试验研究。
关键词： 人参；根；叶片；总RNA；提取方法；反转录酶
中图分类号： S567.5 10.1 文献标志码： A
文章编号：1002-1302（2015）08-0034-04
人参为五加科人参属植物，素有“东北三宝”的美誉，人参皂苷为人参的主要药效成分，具有较好的抗肿瘤、提高机体免疫力、改善心脑血管供血不足、抑制细胞凋亡等药理活性 [1-3]，目前人们已经从人参中分离到了约90个人参皂苷单体 [4-5]。人参皂苷的含量是判断人参质量的主要标准，但是目前对人参功能基因和次生代谢生物合成途径的研究相对较少，人参皂苷的产率较低，次生代谢产物人参皂苷尚未实现人工合成，对于一些含量甚微的单体皂苷的新药开发还较为困难 [6]。人参皂苷的生物合成途径与功能基因表达量之间的关系仍处于探究阶段 [7]，因此深入了解人参皂苷的生物合成途径及其调控机理，并在分子水平上实现人参皂苷的人工合成，这是利用生物技术手段大量生产人参皂苷的必要前提。
为了探究人参皂苷生物合成途径与功能基因表达量之间的关系，首要的问题是提取完整性好、纯度高的总RNA。由于植物细胞组成成分复杂多样，使得植物组织总RNA的提取难于其他生物材料。成熟的人参组织中含有大量的酚类、糖类，人参组织的研磨过程破坏了酚类物质与多酚氧化酶的平衡分布，酚类极易被氧化成醌，并易与RNA分子发生不可逆结合，产生褐化反应 [8]，从而影响RNA的提取，导致RNA的产量、质量较差。本研究比较了7种提取人参根、叶片总RNA的方法，筛选出适合提取人参根、叶片总RNA的提取方法，并用该方法提取出完整性好、纯度高的总RNA。反转录可以检测提取的总RNA质量，反转录酶的不同直接决定反转录效果，本试验比较了3种反转录酶对总RNA的转录情况，筛选出转录效果较好的方法，为人参皂苷合成途径中功能基因的克隆与功能研究奠定了一定的理论基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
五年生人参取自吉林省抚松县抚南林场（42°03′06″N，127°33′21″E，海拔903 m），用刀将根部切成小块，放入冻存管迅速用液氮冷冻，于-80 ℃保存待用，叶片进行同样处理，试验所用部位为人参根、叶片。
1.2 试剂与仪器
1.2.1 试剂 TaKaRa MiniBEST总RNA提取试剂盒（TaKaRa，大连）；多糖多酚植物总 RNA快速提取试剂盒、RNAPure高纯总RNA快速提取试剂盒（BioTeke，长春）；RNeasy Plant Mini 试剂盒（Qiagen，德国）；EASY spin Plus植物RNA快速提取试剂盒（艾德莱，北京）；Reverse Transcriptase M-MLV（RNase H-）、PrimeScript Reverse Transcriptase 2个反转录试剂盒（TaKaRa，大连）；GoScript TM Reverse Transcription System反转录试剂盒（Promega，北京）；异硫氰酸胍；DEPC（焦磷酸二乙酯）；CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）；DL2000 DNA Marker（TaKaRa，大连）；生化试剂酚、三氯甲烷、异戊醇等均为国产分析纯。试验中所用的塑料制品如 Eppendorf 管、枪头等均为RNase free制品，玻璃器皿、研钵等于180 ℃干热灭菌8 h。
1.2.2 仪器 ND 2000超微量核酸蛋白测定仪（德国K
关键词： 人参；根；叶片；总RNA；提取方法；反转录酶
中图分类号： S567.5 10.1 文献标志码： A
文章编号：1002-1302（2015）08-0034-04
人参为五加科人参属植物，素有“东北三宝”的美誉，人参皂苷为人参的主要药效成分，具有较好的抗肿瘤、提高机体免疫力、改善心脑血管供血不足、抑制细胞凋亡等药理活性 [1-3]，目前人们已经从人参中分离到了约90个人参皂苷单体 [4-5]。人参皂苷的含量是判断人参质量的主要标准，但是目前对人参功能基因和次生代谢生物合成途径的研究相对较少，人参皂苷的产率较低，次生代谢产物人参皂苷尚未实现人工合成，对于一些含量甚微的单体皂苷的新药开发还较为困难 [6]。人参皂苷的生物合成途径与功能基因表达量之间的关系仍处于探究阶段 [7]，因此深入了解人参皂苷的生物合成途径及其调控机理，并在分子水平上实现人参皂苷的人工合成，这是利用生物技术手段大量生产人参皂苷的必要前提。
为了探究人参皂苷生物合成途径与功能基因表达量之间的关系，首要的问题是提取完整性好、纯度高的总RNA。由于植物细胞组成成分复杂多样，使得植物组织总RNA的提取难于其他生物材料。成熟的人参组织中含有大量的酚类、糖类，人参组织的研磨过程破坏了酚类物质与多酚氧化酶的平衡分布，酚类极易被氧化成醌，并易与RNA分子发生不可逆结合，产生褐化反应 [8]，从而影响RNA的提取，导致RNA的产量、质量较差。本研究比较了7种提取人参根、叶片总RNA的方法，筛选出适合提取人参根、叶片总RNA的提取方法，并用该方法提取出完整性好、纯度高的总RNA。反转录可以检测提取的总RNA质量，反转录酶的不同直接决定反转录效果，本试验比较了3种反转录酶对总RNA的转录情况，筛选出转录效果较好的方法，为人参皂苷合成途径中功能基因的克隆与功能研究奠定了一定的理论基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
五年生人参取自吉林省抚松县抚南林场（42°03′06″N，127°33′21″E，海拔903 m），用刀将根部切成小块，放入冻存管迅速用液氮冷冻，于-80 ℃保存待用，叶片进行同样处理，试验所用部位为人参根、叶片。
1.2 试剂与仪器
1.2.1 试剂 TaKaRa MiniBEST总RNA提取试剂盒（TaKaRa，大连）；多糖多酚植物总 RNA快速提取试剂盒、RNAPure高纯总RNA快速提取试剂盒（BioTeke，长春）；RNeasy Plant Mini 试剂盒（Qiagen，德国）；EASY spin Plus植物RNA快速提取试剂盒（艾德莱，北京）；Reverse Transcriptase M-MLV（RNase H-）、PrimeScript Reverse Transcriptase 2个反转录试剂盒（TaKaRa，大连）；GoScript TM Reverse Transcription System反转录试剂盒（Promega，北京）；异硫氰酸胍；DEPC（焦磷酸二乙酯）；CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）；DL2000 DNA Marker（TaKaRa，大连）；生化试剂酚、三氯甲烷、异戊醇等均为国产分析纯。试验中所用的塑料制品如 Eppendorf 管、枪头等均为RNase free制品，玻璃器皿、研钵等于180 ℃干热灭菌8 h。
1.2.2 仪器 ND 2000超微量核酸蛋白测定仪（德国K