【摘 要】
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【目的】构建混合谱系激酶结构域样（mixed lineage kinase domain-like, MLKL）基因敲除的PK-15细胞株（PK-15 MLKL-KO）,研究敲除MLKL基因对猪伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus, PRV）复制的影响。【方法】根据MLKL序列设计特异性编辑位点，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建MLKL-sgRNA编辑载体，转染至PK-15
【基金项目】
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国家“十三五”重点研发专项课题（2018YFD0500804、2016YFD0500709）； 国家自然科学基金青年科学基金项目（31902273）； 广东省自然科学基金项目（2019A1515010757、2017A030310074）； 广州市科技计划项目一般项目（20180401
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【目的】构建混合谱系激酶结构域样（mixed lineage kinase domain-like, MLKL）基因敲除的PK-15细胞株（PK-15 MLKL-KO）,研究敲除MLKL基因对猪伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus, PRV）复制的影响。【方法】根据MLKL序列设计特异性编辑位点，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建MLKL-sgRNA编辑载体，转染至PK-15细胞，经嘌呤霉素药物筛选获得多克隆细胞系，通过有限稀释法获得PK-15 MLKL-KO单克隆细胞株。通过靶基因组PCR、测序和Western blotting验证MLKL基因在PK-15细胞上的敲除水平；采用Reed-Muench法检测病毒增殖水平；采用PI染色和荧光显微镜观察细胞坏死情况。【结果】试验成功构建MLKL-sgRNA载体，筛选出1株MLKL基因缺失647 bp的PK-15细胞株，Western blotting未检测到MLKL蛋白的表达。与PK-15细胞相比，PK-15 MLKL-KO细胞极显著或显著提高了PRV GD-WH（感染后36 h除外）和PRV Bartha-K61的病毒滴度（P＜0.01;P＜0.05）。PRV GD-WH和PRV Bartha-K61感染PK-15 MLKL-KO细胞后，坏死细胞明显减少。【结论】本研究构建了MLKL基因敲除的PK-15细胞株，与PK-15细胞相比，PK-15 MLKL-KO细胞显著提高了PRV GD-WH和PRV Bartha-K61的复制和存活能力，为PRV Bartha-K61疫苗生产过程中提高病毒产量提供了一种可行性策略。
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