【摘 要】
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目的 建立高效病毒受体筛选方法,筛选并鉴定人血管内皮细胞膜上与2型登革病毒(DENV-2)相互作用的蛋白.方法 用纯化的DENV-2 E蛋白DⅢ区(EDⅢ)分子代替全病毒颗粒与转印至PVDF
【机 构】
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200137,上海公安学院侦查系;400038重庆,陆军军医大学微生物学教研室重庆市微生物工程实验室
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目的 建立高效病毒受体筛选方法,筛选并鉴定人血管内皮细胞膜上与2型登革病毒(DENV-2)相互作用的蛋白.方法 用纯化的DENV-2 E蛋白DⅢ区(EDⅢ)分子代替全病毒颗粒与转印至PVDF膜的人血管内皮ECV304细胞膜蛋白进行孵育,建立改良的VOPBA和2D-VOPBA技术筛选相互作用蛋白,筛选出的候选蛋白经质谱分析、Western blot和免疫共沉淀(Co-IP)实验鉴定;利用抗体阻断实验和激光共聚焦显微技术观察和验证候选蛋白与DENV-2感染的关系;经生物信息学分析,预测候选蛋白与DENV-2 EDⅢ蛋白的对接复合物模型及其结合热点残基.结果 筛选出相对分子质量34 000、43 000和55 000这3个候选蛋白,其中相对分子质量43 000和55 000蛋白经鉴定分别为细胞骨架微丝蛋白(fibrous-actin,F-actin)和波形蛋白(vimentin),均可与DENV-2 EDⅢ蛋白在体外发生特异性结合,并且vimentin蛋白可表达于人血管内皮细胞表面,其抗体可部分阻断DENV-2感染;激光共聚焦显微镜观察到在DENV-2感染的前5 min就可引起ECV304细胞中actin的重排,并且actin与病毒E蛋白有明显的随感染时间增强的共存现象.最后,利用生物信息学分别预测了actin和vimentin与DENV-2 EDⅢ蛋白的结合模型及结合残基.结论 成功建立了高效的病毒受体筛选技术,并证实筛选到的actin和vimentin蛋白可作为辅助受体或相互作用蛋白,通过与DENV-2 EDⅢ蛋白结合参与DENV-2感染人血管内皮细胞.
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