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摘 要：海带配子体克隆能长期保存，可维持原有性别，对保护海带种质资源，研究海带生理、生化、遗传学、规模化培育及生产等方面均具有重要价值。本文分别从配子体克隆的规模化培养、采苗、幼苗培育3个方面探讨了海带配子体克隆规模化培育及育苗过程中的关键技术。
关键词：海带；配子体克隆；规模化培育
中图分类号：S968 文献标识码：A
我国自发现海带到如今已有7、80a时间，是最早实现海带人工育苗的国家。自20世纪50年代初期，海带养殖业就已成为我国海水养殖领域的龙头产业，如今我国苗种繁育能力已达200亿株，海带养殖面积超过4万hm2，是全球首屈一指的海带栽培大国。
1 海带配子体克隆规模化培养技术要点分析
1.1 培养室
海带配子体克隆规模化培养对培养室提出了一定的要求，除了配备必需的空气消毒及制冷系统以外，要求培养室应具有足够的隔热性。培养室内应进行培养架设置，光源可采用日光灯，充气可采用48m3/h风量的旋涡式充气机，克隆扩大培养的容器可采用18.9L容量的无色矿泉水桶。
1.2 培养液
选择自然海水，经过沉淀、砂滤、煮沸、冷却，或在培养室内进行预冷，后加入NaNO3-N 10g/m3，KH2PO4-P 1g/m3等营养盐。若配子体克隆鲜干重每瓶超过8g，应将培养液中KH2PO4-P的含量提高至2g/m3。
1.3 接种
采用高速组织捣碎机对海带配子体克隆簇状体进行切割，切割为大小在200～400μm之间的细胞段，接种于有效培养水体容量5000mL的3角烧瓶中。应根据配子体克隆重量的1～1.5g/L进行接种，切忌接种密度过低。在用高速组织捣碎机切割后会造成许多细胞机械性损伤，接种水体相对浑浊，极易滋生大量细菌，对配子体克隆的生长带来不利影响，因此，对于初始接种的克隆瓶要增加换水频率，最好每天更换，待水体稳定后改为10～15d更换。
1.4 规模化培养条件
1.4.1 簇状体切割时间控制
规模化培养研究表明，待簇状体直径达2mm时，即需要采用高速组织捣碎机切割，切割时间在10s左右，使细胞段长200μm。
1.4.2 温度控制
研究显示，15℃下克隆生长速度最快但极易受到杂菌的污染，规模化培养应将温度控制在10～13℃之间。
1.4.3 雄配子体克隆规模化培养起始时间
研究显示，雌雄配子体克隆规模化培养比例应为2：1，雄配子体生长速度更快，因此，应将雄配子体克隆起始培养时间稍推迟。
1.4.4 光照影响
规模化培养中，应将1500～2500Lux作为配子体克隆的最适宜光照，将温度5～10℃200Lux以下光强及静置培养作为海带种质保存的有效途径。
1.4.5 充气悬浮培养
充气悬浮培养下，配子体克隆生长速度较静置培养显著提高，同时，应注意将空气采用小滤器进行过滤，以防水质污染。
1.4.6 换水及清洗
规模化培养过程中，若克隆生长情况欠佳，粉碎时间过短，水质存在污染时，应相应增加换水次数，可将克隆置于300目筛绢上，采用喷雾器进行多次冲洗，直至镜检克隆没有附着物为止。此外，还可施加一定量抗生素，以抑制细菌的生长。
2 采苗过程的技术要点
采苗多在8月上旬进行，切忌将规模化培养的雌雄配子体克隆直接喷洒在苗帘上，这样易造成细胞团脱落、密度超标等情况。采苗时应采用发育状态下的均匀小细胞段进行喷洒。
2.1 一次分离
将规模化培养的雌雄克隆按鲜重2：1的比例混合，在组织捣碎机进行切割，交替采用快、慢切割，时间控制在10～15s，切割为500～600μm细胞段。
2.2 短光照培养
采苗前7～16d进行短光照培养，密度控制在250g/瓶，10h光照下采用充气悬浮进行培养，温度为8～12℃，光强1500lx。
2.3 二次分离
短光照培养后，喷洒苗帘前须进行2次切割，经400目筛绢过滤，所得细胞段多数为1～5个细胞。
2.4 采苗方法
滤出细胞液用低温海水稀释，采用孔径1.2mm的自制专用喷洒设备将其喷洒于培育池静水水面中，细胞段受到重力沉落在苗帘上。采用单、双号池分开进行，第1天采用单号池进行采苗，双号池用循环流低温水降温，隔天用双号池采苗，单号池微流水。各苗帘按克隆鲜重1g均匀喷洒。
3 幼苗培育技术要点分析
此过程需要在繁育间进行，雌雄克隆经2个月的培育，所获得幼苗可出库。
3.1 水温控制
采苗过程水温控制在6～7℃，确保静水培育水温在15℃以内，以防不利于配子体发育。静水培育过程中，为避免采苗池水温升高，在相邻培育池应采用循环流低温海水降温法控制采苗池的水温，流水过程中水温为8～10℃。
3.2 光照控制
基础平均光控制在1300～14001x，高光为2700lx。前期5d提1次光，1次平均提1001x，高光提200lx，后期每3d提1次光，1次平均提150～200lx，高光1次提300～400lx。
3.3 营养盐
配-孢子体5mm，NaNO3-N 3g/m3，KH2PO4-P 0.3g/m3；5mm至出库，NaNO3-N 4g/m3，KH2PO4-P 0.4g/m3。孢子体长到2-4列细胞时，采用FeC6H5O7·5H2O-Fe 0.02g/m3培养20d。
3.4 水流调节
采苗第1天用静水，48h后为微流水，72h后正常流水。
3.5 新水量
前期新水量占总量1/2，中期为2/3，后期为5/6。
目前，在海带配子体克隆规模化培育及育苗技术中仍存在不少技术难点还未攻关，例如，适用于规模化生产的水处理技术、高效克隆分离法、有效的发育诱导法等，需进一步研究，为提升我国海带配子体克隆的规模化培育及生产提供技术支持。
参考文献
[1] 王素娟.海藻生物技术[M].上海：上海科学技术出版社，2004.
[2] 曾呈奎，王秦娟，刘思俭，等. 海藻栽培学[M].上海：上海科学技术出版社，2008.
[3] 韩宝芹，崔竞进，刘涛，等.海带配子体克隆的培养及应用[J].青岛海洋大学学报（自然科学版），2000，30（z1）：203-206.
关键词：海带；配子体克隆；规模化培育
中图分类号：S968 文献标识码：A
我国自发现海带到如今已有7、80a时间，是最早实现海带人工育苗的国家。自20世纪50年代初期，海带养殖业就已成为我国海水养殖领域的龙头产业，如今我国苗种繁育能力已达200亿株，海带养殖面积超过4万hm2，是全球首屈一指的海带栽培大国。
1 海带配子体克隆规模化培养技术要点分析
1.1 培养室
海带配子体克隆规模化培养对培养室提出了一定的要求，除了配备必需的空气消毒及制冷系统以外，要求培养室应具有足够的隔热性。培养室内应进行培养架设置，光源可采用日光灯，充气可采用48m3/h风量的旋涡式充气机，克隆扩大培养的容器可采用18.9L容量的无色矿泉水桶。
1.2 培养液
选择自然海水，经过沉淀、砂滤、煮沸、冷却，或在培养室内进行预冷，后加入NaNO3-N 10g/m3，KH2PO4-P 1g/m3等营养盐。若配子体克隆鲜干重每瓶超过8g，应将培养液中KH2PO4-P的含量提高至2g/m3。
1.3 接种
采用高速组织捣碎机对海带配子体克隆簇状体进行切割，切割为大小在200～400μm之间的细胞段，接种于有效培养水体容量5000mL的3角烧瓶中。应根据配子体克隆重量的1～1.5g/L进行接种，切忌接种密度过低。在用高速组织捣碎机切割后会造成许多细胞机械性损伤，接种水体相对浑浊，极易滋生大量细菌，对配子体克隆的生长带来不利影响，因此，对于初始接种的克隆瓶要增加换水频率，最好每天更换，待水体稳定后改为10～15d更换。
1.4 规模化培养条件
1.4.1 簇状体切割时间控制
规模化培养研究表明，待簇状体直径达2mm时，即需要采用高速组织捣碎机切割，切割时间在10s左右，使细胞段长200μm。
1.4.2 温度控制
研究显示，15℃下克隆生长速度最快但极易受到杂菌的污染，规模化培养应将温度控制在10～13℃之间。
1.4.3 雄配子体克隆规模化培养起始时间
研究显示，雌雄配子体克隆规模化培养比例应为2：1，雄配子体生长速度更快，因此，应将雄配子体克隆起始培养时间稍推迟。
1.4.4 光照影响
规模化培养中，应将1500～2500Lux作为配子体克隆的最适宜光照，将温度5～10℃200Lux以下光强及静置培养作为海带种质保存的有效途径。
1.4.5 充气悬浮培养
充气悬浮培养下，配子体克隆生长速度较静置培养显著提高，同时，应注意将空气采用小滤器进行过滤，以防水质污染。
1.4.6 换水及清洗
规模化培养过程中，若克隆生长情况欠佳，粉碎时间过短，水质存在污染时，应相应增加换水次数，可将克隆置于300目筛绢上，采用喷雾器进行多次冲洗，直至镜检克隆没有附着物为止。此外，还可施加一定量抗生素，以抑制细菌的生长。
2 采苗过程的技术要点
采苗多在8月上旬进行，切忌将规模化培养的雌雄配子体克隆直接喷洒在苗帘上，这样易造成细胞团脱落、密度超标等情况。采苗时应采用发育状态下的均匀小细胞段进行喷洒。
2.1 一次分离
将规模化培养的雌雄克隆按鲜重2：1的比例混合，在组织捣碎机进行切割，交替采用快、慢切割，时间控制在10～15s，切割为500～600μm细胞段。
2.2 短光照培养
采苗前7～16d进行短光照培养，密度控制在250g/瓶，10h光照下采用充气悬浮进行培养，温度为8～12℃，光强1500lx。
2.3 二次分离
短光照培养后，喷洒苗帘前须进行2次切割，经400目筛绢过滤，所得细胞段多数为1～5个细胞。
2.4 采苗方法
滤出细胞液用低温海水稀释，采用孔径1.2mm的自制专用喷洒设备将其喷洒于培育池静水水面中，细胞段受到重力沉落在苗帘上。采用单、双号池分开进行，第1天采用单号池进行采苗，双号池用循环流低温水降温，隔天用双号池采苗，单号池微流水。各苗帘按克隆鲜重1g均匀喷洒。
3 幼苗培育技术要点分析
此过程需要在繁育间进行，雌雄克隆经2个月的培育，所获得幼苗可出库。
3.1 水温控制
采苗过程水温控制在6～7℃，确保静水培育水温在15℃以内，以防不利于配子体发育。静水培育过程中，为避免采苗池水温升高，在相邻培育池应采用循环流低温海水降温法控制采苗池的水温，流水过程中水温为8～10℃。
3.2 光照控制
基础平均光控制在1300～14001x，高光为2700lx。前期5d提1次光，1次平均提1001x，高光提200lx，后期每3d提1次光，1次平均提150～200lx，高光1次提300～400lx。
3.3 营养盐
配-孢子体5mm，NaNO3-N 3g/m3，KH2PO4-P 0.3g/m3；5mm至出库，NaNO3-N 4g/m3，KH2PO4-P 0.4g/m3。孢子体长到2-4列细胞时，采用FeC6H5O7·5H2O-Fe 0.02g/m3培养20d。
3.4 水流调节
采苗第1天用静水，48h后为微流水，72h后正常流水。
3.5 新水量
前期新水量占总量1/2，中期为2/3，后期为5/6。
目前，在海带配子体克隆规模化培育及育苗技术中仍存在不少技术难点还未攻关，例如，适用于规模化生产的水处理技术、高效克隆分离法、有效的发育诱导法等，需进一步研究，为提升我国海带配子体克隆的规模化培育及生产提供技术支持。
参考文献
[1] 王素娟.海藻生物技术[M].上海：上海科学技术出版社，2004.
[2] 曾呈奎，王秦娟，刘思俭，等. 海藻栽培学[M].上海：上海科学技术出版社，2008.
[3] 韩宝芹，崔竞进，刘涛，等.海带配子体克隆的培养及应用[J].青岛海洋大学学报（自然科学版），2000，30（z1）：203-206.