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[摘要] 目的 探討淫羊藿总黄酮（HEP）对脂多糖（LPS）诱导的BV2小胶质细胞炎症反应的作用。
方法 常规培养BV2小胶质细胞，将其分为对照组、LPS组、20 mg/L HEP+LPS组、40 mg/L HEP+LPS组、60 mg/L HEP+LPS组，后3组先用相应浓度HEP预保护1 h，再给予1 mg/L的LPS处理细胞6 h。采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测各组细胞活力，实时反转录聚合酶链反应检测白细胞介素-1β（IL-1β）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）mRNA的表达。
结果1 mg/L的LPS和20、40、60 mg/L的HEP对BV2小胶质细胞活力没有影响（F=0.59，P>0.05）。LPS可明显上调BV2小胶质细胞炎症因子IL-1β和TNF-α mRNA的表达水平（F=28.94、53.28，q=5.908、20.930，P<0.01）;与LPS组相比，20、40、60 mg/L的HEP预处理均能明显抑制LPS诱导的IL-1β和TNF-α mRNA的表达（q=5.097～7.669，P<0.01）。
结论HEP可明显抑制LPS诱导的BV2小胶质细胞IL-1β 和TNF-α mRNA的表达，提示其可能具有抗炎作用。
[关键词] 淫羊藿;黄酮类;小神经胶质细胞;脂多糖类;炎症
[中图分类号] Q426;R592;R364.5
[文献标志码] A
[文章编号] 2096-5532（2019）01-0006-04
EFFECT OF TOTAL FLAVONOIDS OF HERBA EPIMEDII AGAINST LIPOPOLYSACCHARIDE-INDUCED INFLAMMATORY RESPONSE IN BV2 MICROGLIAL CELLS
GU Yu， WANG Haotian， MIAO Yue， Wang Xiaowen， SUN Jiawen， CHEN Wenfang
（Department of Physiology and Pathophysiology， School of Basic Medicine， Qingdao University， Qingdao 266071， China）
[ABSTRACT]ObjectiveTo investigate the effect of total flavonoids of Herba Epimedii （HEP） against lipopolysaccharide （LPS）-induced inflammatory response in BV2 microglial cells.
MethodsBV2 microglial cells were cultured using conventional methods and then divided into control group， LPS group， 20 mg/L HEP+LPS group， 40 mg/L HEP+LPS group， and 60 mg/L HEP+LPS group. The cells in the latter three groups were pretreated with HEP for 1 hour and then treated with 1 mg/L LPS for 6 hours. MTT assay was used to measure cell viability， and real-time RT-PCR was used to measure the mRNA expression of interleukin-1β （IL-1β） and tumor necrosis factor-α （TNF-α）. ResultsLPS at a concentration of 1 mg/L and HEP at concentrations of 20，40， and 60 mg/L had no influence on the viability of BV2 microglial cells （F=0.59，P>0.05）. LPS significantly upregulated the mRNA expression of inflammatory factors IL-1β and TNF-α in BV2 microglial cells （F=28.94 and 53.28，q=5.908 and 20.930，P<0.01）. Compared with the LPS group， the 20，40， and 60 mg/L HEP+LPS groups had significant reductions in the mRNA expression of IL-1β and TNF-α induced by LPS （q=5.097-7.669，P<0.01）.
ConclusionHEP can significantly inhibit the mRNA expression of IL-1β and TNF-α induced by LPS in BV2 microglial cells， suggesting that HEP may have an anti-inflammatory effect.
[KEY WORDS]Epimedium Brevicornum; flavones; microglia; lipopolysaccharides; inflammation 越来越多的临床和实验证据表明，慢性炎症与神经退行性疾病如帕金森病和老年痴呆等的发病密切相关[1-4]。在各种致炎因子的作用下，小胶质细胞过度激活，释放肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）等炎性因子，这些炎性因子可导致神经元的损伤[5]。因此，有效抑制小胶质细胞的炎症反应，将为神经退行性疾病的治疗提供有益思路。淫羊藿作为一种传统中药[6]，400多年前已被广泛应用于多种配方中，被认为能够“滋肾脏，强壮阳”[7]。淫羊藿总黄酮（HEP）是淫羊藿的主要活性成分，具有明显的抗衰老、抗炎、抗骨质疏松[8]、改善学习记忆能力[9]等作用。本实验室在前期工作中，从淫羊藿总提取物中分离获得了HEP，并分离鉴定了21种黄酮类化合物，指认了HEP活性馏分中的主要色谱峰[10]。应用帕金森病小鼠模型和离体细胞模型研究结果均证实HEP能够对抗神经毒素1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶（MPTP）对多巴胺（DA）能神经元的损伤[11]。有研究表明，HEP能够通过抑制MAPK/NF-κB信号通路，减轻自然衰老大鼠脑组织的炎症反应[12]。但HEP对小胶质细胞炎症反应的作用尚未见报道。本研究应用脂多糖（LPS）制备BV2小胶质细胞的炎症模型，
旨在探讨HEP能否对抗LPS诱导的炎症反应，以期为神经退行性疾病的治疗提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 主要试剂及其来源
HEP购于上海同田生物公司;DMEM高糖培养基购自美国Hyclone公司;LPS由Sigma公司提供;四甲基偶氮唑蓝（MTT）由Duchefa公司提供;PCR逆转录试剂盒购自Roche公司;SYBR Green购自美国Takara公司。
1.2 细胞培养
BV2小胶质细胞培养于含体积分数0.10 CellMax胎牛血清、100 kU/L青霉素和100 mg/L链霉素混合双抗的DMEM高糖培养基中，在37 ℃、体积分数0.05 CO2条件下培养。
1.3 MTT法检测药物对细胞活力的影响
将BV2小胶质细胞接种于96孔板中，每孔细胞数为8×103个。当细胞均匀贴壁生长时，用HEP处理细胞24 h后去除培养液，加入5 g/L的MTT溶液，置于37 ℃、含体积分数0.05 CO2的培养箱中继续培养4 h，每孔加入二甲基亚砜（DMSO）溶液100 μL，震荡混匀后用酶标仪检测波长490 nm处的吸光度（A）值，计算细胞存活率[13]。
1.4实时反转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测IL-1β和TNF-α mRNA的表达
将传代细胞接种于12孔板中，分为对照组（A组）、LPS组（B组）、20 mg/L HEP+LPS组（C组）、40 mg/L HEP+LPS组（D组）和60 mg/L HEP+LPS组（E组）。后3组细胞先用相应浓度HEP预保护1 h，再给予1 mg/L的LPS处理细胞6 h。采用Trizol法冰上裂解各组细胞10～20 min，小心从细胞中提取总RNA，取2 μg总RNA加入1 μL锚定的寡聚（dT）18引物，用RNA free water补至13 μL，55 ℃变性10 min;随后向上述反应物中加入7 μL的反应体系（内含逆转录酶0.5 μL、RNase抑制剂0.5 μL、缓冲液4.0 μL以及dNTP 2.0 μL），55 ℃作用30 min，继以85 ℃作用5 min逆转录合成cDNA[14]。采用SYBR Green染料法相对定量检测IL-1β、TNF-α和GAPDH mRNA表达。RT-PCR 检测所用引物及其序列见表1。应用2-△△CT法计算目的基因相对表达量。
1.5 统计学处理
实验所得计量资料结果以[AKx-D]±s形式表示，应用GraphPad Prism 5.0统计学软件进行单因素方差分析（One-Way ANOVA），并继以Tukey法进行两两比较。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1LPS和不同浓度HEP对BV2小胶质细胞活力的影响
用LPS（1 mg/L）和不同浓度的HEP（20、40、60 mg/L）分别处理细胞24 h，4组细胞存活率分别为0.989±0.058、1.053±0.108、1.006±0.136和1.094±0.184，与对照组（1.000±0.110）相比差异无显著性（F=0.59，P>0.05）。表明1 mg/L的LPS和20、40、60 mg/L的HEP对BV2小胶质细胞的活力没有明显影响，本研究选用的药物浓度对细胞没有毒性。
2.2HEP对LPS诱导的BV2小胶质细胞IL-1β 和TNF-α mRNA表达的作用
与对照组相比，LPS处理BV2小胶质细胞6 h，可使炎性因子IL-1β和TNF-α mRNA的表达分别升高11.49和5.73倍（F=28.94、53.28，q=16.520、20.550，P<0.01）。应用20、40、60 mg/L的HEP预处理均能明显抑制LPS诱导的IL-1β和TNF-α mRNA的表达，与LPS组相比，IL-1β mRNA表达分别下降了29%、31%和41%（q=5.278～5.629，P<0.01），TNF-α mRNA表达分别下降了17%、20%和39%（q=5.097～7.669，P<0.01）。见表2。
3 讨 论
HEP作为淫羊藿的主要活性成分，具有多种药理作用。大量研究表明，HEP具有抗骨质疏松和神经保护作用，能够促进成骨细胞的生成，明显对抗MPTP诱导的帕金森病模型小鼠黑質纹状体系统DA能神经元的损伤[15-20];HEP可通过直接增加免疫细胞的数量，促进免疫细胞分泌淋巴因子，从而提高免疫力[21];HEP及其主要活性成分淫羊藿苷预保护，可以通过AMPK/SIRT1/NF-κB信号通路，减轻自然衰老大鼠睾丸组织炎症反应[22]。此外，有研究表明，HEP能通过下调促炎细胞因子表达以及上调抗炎因子表达干预老年大鼠海马炎性衰老[23]。近年来炎症反应在神经退行性疾病发病过程中的作用越来越受到人们的重视。尸检结果表明，帕金森病病人的黑质含有大量的反应性小胶质细胞，过度激活的小胶质细胞导致了DA能神经元的损伤和丢失。因此，阻止炎性因子的产生、抑制炎症反应被认为是治疗中枢炎症反应性疾病的一条有效途径。 LPS为革兰阴性菌细胞壁的组成成分，被广泛用于炎症反应的诱导[24]。本研究应用LPS制备了BV2小胶质细胞系炎症模型，通过检测炎性因子IL-1β和TNF-α mRNA的水平，探讨了不同浓度HEP对炎性反应中小胶质细胞活化的抑制作用。IL-1β是由活化的巨噬細胞产生的一种细胞因子，可作用于白细胞或免疫细胞，在炎症反应中发挥着重要的作用。TNF-α主要由单核巨噬细胞产生，与炎症反应的诱导及维持有密切关系。本文结果显示，LPS处理可明显上调BV2小胶质细胞炎性因子IL-1β和TNF-α mRNA的表达，应用20～60 mg/L的HEP预保护对LPS诱导的IL-1β和TNF-α mRNA表达均有明显抑制作用，其中以60 mg/L HEP的抗炎作用最明显。提示HEP能够抑制LPS诱导的小胶质细胞的激活。有研究发现，HEP中的主要活性成分能够选择性激活雌激素受体，刺激成骨细胞的产生[10]。HEP及其主要活性成分是否能够通过雌激素受体发挥抗炎作用，我们将在后续的实验中进一步探讨。
综上所述，HEP能明显对抗LPS诱导的BV2小胶质细胞的炎症反应，抑制炎性因子IL-1β和TNF-α mRNA的表达。本文研究结果为HEP对抗中枢神经系统炎症反应提供了实验依据。
[参考文献]
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方法 常规培养BV2小胶质细胞，将其分为对照组、LPS组、20 mg/L HEP+LPS组、40 mg/L HEP+LPS组、60 mg/L HEP+LPS组，后3组先用相应浓度HEP预保护1 h，再给予1 mg/L的LPS处理细胞6 h。采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测各组细胞活力，实时反转录聚合酶链反应检测白细胞介素-1β（IL-1β）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）mRNA的表达。
结果1 mg/L的LPS和20、40、60 mg/L的HEP对BV2小胶质细胞活力没有影响（F=0.59，P>0.05）。LPS可明显上调BV2小胶质细胞炎症因子IL-1β和TNF-α mRNA的表达水平（F=28.94、53.28，q=5.908、20.930，P<0.01）;与LPS组相比，20、40、60 mg/L的HEP预处理均能明显抑制LPS诱导的IL-1β和TNF-α mRNA的表达（q=5.097～7.669，P<0.01）。
结论HEP可明显抑制LPS诱导的BV2小胶质细胞IL-1β 和TNF-α mRNA的表达，提示其可能具有抗炎作用。
[关键词] 淫羊藿;黄酮类;小神经胶质细胞;脂多糖类;炎症
[中图分类号] Q426;R592;R364.5
[文献标志码] A
[文章编号] 2096-5532（2019）01-0006-04
EFFECT OF TOTAL FLAVONOIDS OF HERBA EPIMEDII AGAINST LIPOPOLYSACCHARIDE-INDUCED INFLAMMATORY RESPONSE IN BV2 MICROGLIAL CELLS
GU Yu， WANG Haotian， MIAO Yue， Wang Xiaowen， SUN Jiawen， CHEN Wenfang
（Department of Physiology and Pathophysiology， School of Basic Medicine， Qingdao University， Qingdao 266071， China）
[ABSTRACT]ObjectiveTo investigate the effect of total flavonoids of Herba Epimedii （HEP） against lipopolysaccharide （LPS）-induced inflammatory response in BV2 microglial cells.
MethodsBV2 microglial cells were cultured using conventional methods and then divided into control group， LPS group， 20 mg/L HEP+LPS group， 40 mg/L HEP+LPS group， and 60 mg/L HEP+LPS group. The cells in the latter three groups were pretreated with HEP for 1 hour and then treated with 1 mg/L LPS for 6 hours. MTT assay was used to measure cell viability， and real-time RT-PCR was used to measure the mRNA expression of interleukin-1β （IL-1β） and tumor necrosis factor-α （TNF-α）. ResultsLPS at a concentration of 1 mg/L and HEP at concentrations of 20，40， and 60 mg/L had no influence on the viability of BV2 microglial cells （F=0.59，P>0.05）. LPS significantly upregulated the mRNA expression of inflammatory factors IL-1β and TNF-α in BV2 microglial cells （F=28.94 and 53.28，q=5.908 and 20.930，P<0.01）. Compared with the LPS group， the 20，40， and 60 mg/L HEP+LPS groups had significant reductions in the mRNA expression of IL-1β and TNF-α induced by LPS （q=5.097-7.669，P<0.01）.
ConclusionHEP can significantly inhibit the mRNA expression of IL-1β and TNF-α induced by LPS in BV2 microglial cells， suggesting that HEP may have an anti-inflammatory effect.
[KEY WORDS]Epimedium Brevicornum; flavones; microglia; lipopolysaccharides; inflammation 越来越多的临床和实验证据表明，慢性炎症与神经退行性疾病如帕金森病和老年痴呆等的发病密切相关[1-4]。在各种致炎因子的作用下，小胶质细胞过度激活，释放肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）等炎性因子，这些炎性因子可导致神经元的损伤[5]。因此，有效抑制小胶质细胞的炎症反应，将为神经退行性疾病的治疗提供有益思路。淫羊藿作为一种传统中药[6]，400多年前已被广泛应用于多种配方中，被认为能够“滋肾脏，强壮阳”[7]。淫羊藿总黄酮（HEP）是淫羊藿的主要活性成分，具有明显的抗衰老、抗炎、抗骨质疏松[8]、改善学习记忆能力[9]等作用。本实验室在前期工作中，从淫羊藿总提取物中分离获得了HEP，并分离鉴定了21种黄酮类化合物，指认了HEP活性馏分中的主要色谱峰[10]。应用帕金森病小鼠模型和离体细胞模型研究结果均证实HEP能够对抗神经毒素1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶（MPTP）对多巴胺（DA）能神经元的损伤[11]。有研究表明，HEP能够通过抑制MAPK/NF-κB信号通路，减轻自然衰老大鼠脑组织的炎症反应[12]。但HEP对小胶质细胞炎症反应的作用尚未见报道。本研究应用脂多糖（LPS）制备BV2小胶质细胞的炎症模型，
旨在探讨HEP能否对抗LPS诱导的炎症反应，以期为神经退行性疾病的治疗提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 主要试剂及其来源
HEP购于上海同田生物公司;DMEM高糖培养基购自美国Hyclone公司;LPS由Sigma公司提供;四甲基偶氮唑蓝（MTT）由Duchefa公司提供;PCR逆转录试剂盒购自Roche公司;SYBR Green购自美国Takara公司。
1.2 细胞培养
BV2小胶质细胞培养于含体积分数0.10 CellMax胎牛血清、100 kU/L青霉素和100 mg/L链霉素混合双抗的DMEM高糖培养基中，在37 ℃、体积分数0.05 CO2条件下培养。
1.3 MTT法检测药物对细胞活力的影响
将BV2小胶质细胞接种于96孔板中，每孔细胞数为8×103个。当细胞均匀贴壁生长时，用HEP处理细胞24 h后去除培养液，加入5 g/L的MTT溶液，置于37 ℃、含体积分数0.05 CO2的培养箱中继续培养4 h，每孔加入二甲基亚砜（DMSO）溶液100 μL，震荡混匀后用酶标仪检测波长490 nm处的吸光度（A）值，计算细胞存活率[13]。
1.4实时反转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测IL-1β和TNF-α mRNA的表达
将传代细胞接种于12孔板中，分为对照组（A组）、LPS组（B组）、20 mg/L HEP+LPS组（C组）、40 mg/L HEP+LPS组（D组）和60 mg/L HEP+LPS组（E组）。后3组细胞先用相应浓度HEP预保护1 h，再给予1 mg/L的LPS处理细胞6 h。采用Trizol法冰上裂解各组细胞10～20 min，小心从细胞中提取总RNA，取2 μg总RNA加入1 μL锚定的寡聚（dT）18引物，用RNA free water补至13 μL，55 ℃变性10 min;随后向上述反应物中加入7 μL的反应体系（内含逆转录酶0.5 μL、RNase抑制剂0.5 μL、缓冲液4.0 μL以及dNTP 2.0 μL），55 ℃作用30 min，继以85 ℃作用5 min逆转录合成cDNA[14]。采用SYBR Green染料法相对定量检测IL-1β、TNF-α和GAPDH mRNA表达。RT-PCR 检测所用引物及其序列见表1。应用2-△△CT法计算目的基因相对表达量。
1.5 统计学处理
实验所得计量资料结果以[AKx-D]±s形式表示，应用GraphPad Prism 5.0统计学软件进行单因素方差分析（One-Way ANOVA），并继以Tukey法进行两两比较。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1LPS和不同浓度HEP对BV2小胶质细胞活力的影响
用LPS（1 mg/L）和不同浓度的HEP（20、40、60 mg/L）分别处理细胞24 h，4组细胞存活率分别为0.989±0.058、1.053±0.108、1.006±0.136和1.094±0.184，与对照组（1.000±0.110）相比差异无显著性（F=0.59，P>0.05）。表明1 mg/L的LPS和20、40、60 mg/L的HEP对BV2小胶质细胞的活力没有明显影响，本研究选用的药物浓度对细胞没有毒性。
2.2HEP对LPS诱导的BV2小胶质细胞IL-1β 和TNF-α mRNA表达的作用
与对照组相比，LPS处理BV2小胶质细胞6 h，可使炎性因子IL-1β和TNF-α mRNA的表达分别升高11.49和5.73倍（F=28.94、53.28，q=16.520、20.550，P<0.01）。应用20、40、60 mg/L的HEP预处理均能明显抑制LPS诱导的IL-1β和TNF-α mRNA的表达，与LPS组相比，IL-1β mRNA表达分别下降了29%、31%和41%（q=5.278～5.629，P<0.01），TNF-α mRNA表达分别下降了17%、20%和39%（q=5.097～7.669，P<0.01）。见表2。
3 讨 论
HEP作为淫羊藿的主要活性成分，具有多种药理作用。大量研究表明，HEP具有抗骨质疏松和神经保护作用，能够促进成骨细胞的生成，明显对抗MPTP诱导的帕金森病模型小鼠黑質纹状体系统DA能神经元的损伤[15-20];HEP可通过直接增加免疫细胞的数量，促进免疫细胞分泌淋巴因子，从而提高免疫力[21];HEP及其主要活性成分淫羊藿苷预保护，可以通过AMPK/SIRT1/NF-κB信号通路，减轻自然衰老大鼠睾丸组织炎症反应[22]。此外，有研究表明，HEP能通过下调促炎细胞因子表达以及上调抗炎因子表达干预老年大鼠海马炎性衰老[23]。近年来炎症反应在神经退行性疾病发病过程中的作用越来越受到人们的重视。尸检结果表明，帕金森病病人的黑质含有大量的反应性小胶质细胞，过度激活的小胶质细胞导致了DA能神经元的损伤和丢失。因此，阻止炎性因子的产生、抑制炎症反应被认为是治疗中枢炎症反应性疾病的一条有效途径。 LPS为革兰阴性菌细胞壁的组成成分，被广泛用于炎症反应的诱导[24]。本研究应用LPS制备了BV2小胶质细胞系炎症模型，通过检测炎性因子IL-1β和TNF-α mRNA的水平，探讨了不同浓度HEP对炎性反应中小胶质细胞活化的抑制作用。IL-1β是由活化的巨噬細胞产生的一种细胞因子，可作用于白细胞或免疫细胞，在炎症反应中发挥着重要的作用。TNF-α主要由单核巨噬细胞产生，与炎症反应的诱导及维持有密切关系。本文结果显示，LPS处理可明显上调BV2小胶质细胞炎性因子IL-1β和TNF-α mRNA的表达，应用20～60 mg/L的HEP预保护对LPS诱导的IL-1β和TNF-α mRNA表达均有明显抑制作用，其中以60 mg/L HEP的抗炎作用最明显。提示HEP能够抑制LPS诱导的小胶质细胞的激活。有研究发现，HEP中的主要活性成分能够选择性激活雌激素受体，刺激成骨细胞的产生[10]。HEP及其主要活性成分是否能够通过雌激素受体发挥抗炎作用，我们将在后续的实验中进一步探讨。
综上所述，HEP能明显对抗LPS诱导的BV2小胶质细胞的炎症反应，抑制炎性因子IL-1β和TNF-α mRNA的表达。本文研究结果为HEP对抗中枢神经系统炎症反应提供了实验依据。
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