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摘 要 甲壳质是真菌细胞壁、昆虫外骨骼和甲壳类动物外壳的主要成分。甲壳质的降解主要依赖甲壳质酶的水解作用。诱导PR-3类甲壳质酶蛋白积累是植物增强对真菌性病害抗性的适应性机制。柱花草是一种重要的热带豆科牧草，由胶孢炭疽菌引起的炭疽病是危及柱花草生产的主要真菌性病害。但柱花草甲壳质酶对炭疽菌侵染的响应仍不清楚。本研究旨在鉴定柱花草PR-3类甲壳质酶基因，并对其表达模式、编码蛋白的生化酶学性质进行分析。结果表明：通过同源克隆获得了1个柱花草PR-3类甲壳质酶基因，其编码区序列全长984 bp，属于糖苷水解酶19家族的ClassⅠ亚族，将其命名为SgGH19-1。荧光定量PCR分析表明，接种炭疽菌诱导SgGH19-1在柱花草叶片中显著增强表达，并伴随着甲壳质酶活性的提高。随后，在大肠杆菌中表达纯化了SgGH19-1重组蛋白，生化酶学性质表明，SgGH19-1蛋白兼具甲壳质内切酶与外切酶活性，但內切酶活性比外切酶活性高9.1倍。SgGH19-1的最适pH为5.0，最适温度为40 ℃。综上所述，SgGH19-1基因参与柱花草对炭疽菌侵染的响应，其编码的蛋白具有甲壳质酶活性，可作为柱花草抗炭疽病育种的分子标记。
关键词 甲壳质;甲壳质酶;柱花草;蛋白纯化;酶学性质
中图分类号 S541 文献标识码 A
Cloning and Expression of a Chitinase Gene SgGH19-1 from Stylosanthes and Its Enzymatic Properties Analysis
LIU Pandao1， WU Xique2， LUO Jiajia1， XU Wenrong2*， LIU Guodao1*
1. Tropical Crops Genetic Resources Institute， Chinese Academy of Tropical Agriculture Sciences / Key Laboratory of Crop Gene Resources and Germplasm Enhancement in Southern China， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Haikou， Hainan 571101， China; 2. Department of Chemistry， School of Science， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China
Abstract Chitin is a major component of the cell wall of fungi， exoskeleton of insects， and crustacean shells. Chitinase is one of the main hydrolase that catalyzes the degradation of chitin. Induction of PR-3 chitinase protein accumulation is an adaptive mechanism for plants to enhance the resistance to fungal diseases. Stylo （Stylosanthes spp.） is an important tropical forage legume. Although anthracnose caused by Colletotrichum gloeosporioides is one of the most destructive fungal diseases of stylo， little information is available regarding the responses of stylo chitinase during the pathogen infection. In the study， the PR-3 chitinase of stylo was characterized， and its expression pattern and biochemical properties were also analyzed. The results showed that a chitinase gene of PR-3 group in stylo was the cloned by homologous gene sequence method， and its coding region was 984 bp. The gene belongs to the Class I chitinase of the glycoside hydrolase 19 family， and was named SgGH19-1. Quantitative PCR analysis showed that the expression level of SgGH19-1 gene in the leaves of stylo was significantly increased after C. gloeosporioides infection， and with the increase of chitinase activity. Subsequently， the recombinant protein of SgGH19-1 was expressed and purified in Escherichia coli. Biochemical properties of SgGH19-1 showed both exochitinase and endochitinase activities， and the activities of endochitinase was 9.1 fold higher than that of exochitinase. Furthermore， the optimum pH and temperature for SgGH19-1 activity was 5.0 and 40 ℃ respectively. Taken together， SgGH19-1 is a chitinase that involved in the response of stylo to C. gloeosporioides attack. These results herein suggest that SgGH19-1 could potentially be employed as a new marker gene for developing cultivars of stylo with great tolerance to anthracnose. Keywords chitin; chitinase; Stylosanthes; protein purification; enzymatic property
DOI 10.3969/j.issn.1000-2561.2019.12.014
甲壳质（chitin），又名甲壳素、几丁质，是由N-乙酰-D-氨基葡萄糖（GlcNAc）以β-1，4糖苷键连接而成的天然高分子化合物[1]。甲壳质普遍存在于真菌的细胞壁、蟹虾和贝类等甲壳动物的外壳以及昆虫的外骨骼等[2]。据估计，在自然界中甲壳质的生物合成量每年超过千亿吨，是仅次于纤维素的第二大天然生物质资源[3]。近年来，由甲壳质及其脱乙酰产物壳聚糖（chitosan）降解后产生的衍生物，被用于化工、食品、制药、材料科学和农业等众多领域，具有广阔的应用前景[4-5]。但是目前对甲壳质的降解主要采用化学方法，几乎都要用到强酸、强碱，对环境污染大，且产物分子量不均匀[6]。利用生物酶学方法降解甲壳质具有专一性强、酶解效率高和环保等优点，因此是替代化学方法的理想技术，正受到越来越多的关注[7]。
甲壳质的生物酶解主要通过甲壳质酶（chitinase），也被称为甲壳素酶或几丁质酶。甲壳质酶是一种能够催化甲壳质的β-1，4糖苷键裂解产生N-乙酰葡萄糖胺寡聚体的水解酶类[8]。目前，甲壳质酶已经在细菌、真菌、动物和植物中被广泛鉴定，并根据其对底物的切割位点不同，被分为甲壳质外切酶（exochitinase）和甲壳质内切酶（endochitinase）[9-10]。在植物中，从拟南芥、烟草和菜豆等中鉴定到一类受病原菌诱导表达的PR-3蛋白，它们具有甲壳质酶活性，属于病程相关蛋白（pathogenesis-related proteins， PRs），如拟南芥的AtPR-3，这些甲壳质酶蛋白的主要作用是当植物受到病原菌侵害时，水解真菌细胞壁中的甲壳质，具有抗真菌作用[11]。
柱花草（Stylosanthes spp.）是一种热带和亚热带地区重要的豆科牧草与绿肥植物，可用作饲草、果园覆盖、水土保持和间作等[12]。由真菌类病原菌胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）引起的炭疽病是危及柱花草生产的主要病害[13]。目前，柱花草中PR-3类甲壳质酶基因对炭疽菌侵染的响应仍不清楚。本研究将通过分子生物学方法，同源克隆柱花草PR-3类甲壳质酶基因，并对该基因编码的蛋白进行表达、纯化和生化酶学性质分析，以期解析甲壳质酶在柱花草抗炭疽病过程中发挥的作用。
1 材料与方法
1.1 材料
本研究所用的热研2号柱花草（Stylosanthes guianensis cv. Reyan 2）和胶孢炭疽菌由中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所草业研究室提供。
1.2 方法
1.2.1 柱花草炭疽菌接种 柱花草种子经80 ℃热水浸泡2 min后，播种于装有基质（腐殖土∶蛭石=1∶1）育苗盒中，每3 d浇一次1/2 Hoagland营养液。幼苗培养1个月后，参照Wang等[14]的方法，制备炭疽菌孢子悬浮液并接种柱花草幼苗，简要实验步骤如下：配制马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基，划板接种胶孢炭疽菌，28 ℃暗培养10 d，无菌水洗脱孢子，控制孢子浓度在106个/mL，并加入0.2% Tween-20。接种室温度28 ℃，湿度90%以上，用孢子悬浮液喷洒柱花草幼苗叶片至凝成水珠。分别在接种0、24、48、72、96 h后收取叶片材料用于测定相关指标。
1.2.2 柱花草PR-3同源基因的克隆与进化树分析 柱花草PR-3同源基因的克隆参照Liu等[15]的方法。首先，对不同植物中的PR-3基因进行多序列比对，包括拟南芥（Arabidopsis thaliana）的At3G12500（AtPR-3）、大豆（Glycine max）的Glyma02g04820、蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）的Medtr8g074330和菜豆（Phaseolus vulgaris）的Phvul.003G268500。根据这些基因的保守序列设计同源克隆引物SgPR-3-EST-F/R（表1），以热研2号柱花草的cDNA为模板，通过PCR扩增及测序获得柱花草PR-3同源基因的EST片段序列。随后，采用的SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit试剂盒（Clotech，美国）扩增柱花草PR-3基因的5′末端和3′末端。即根据获得的EST序列分别设计正向和反向引物SgPR-3-5′RACE-R和SgPR-3-3′RACE-F，分别与试剂盒中的通用引物RACE-UPM和RACE-NUP（表1）配对，通过RACE扩增得到5′和3′端序列，拼接后获得柱花草PR-3基因的cDNA全长序列，并用引物SgPR-3-ORF- F/R（表1）扩增全长序列。基因多序列比对、氨基酸序列比对和进化树构建分别采用DNAMAN、Clustal X和MEGA 5软件。根据同源比对结果，将柱花草PR-3基因命名为SgGH19-1。
1.2.3 SgGH19-1基因的表达模式分析 参照刘攀道等[16]的荧光定量PCR（qRT-PCR）方法分析SgGH19-1基因的表达模式。即：柱花草总RNA提取采用TRIzol试剂盒（Invitrogen，美国）;cDNA第1链合成采用M-MLV反转录酶试剂盒（Promega，美国）;qRT-PCR分析运用SYBR Green（TaKaRa，日本）试剂盒在Rotor-Gene 3000 qRT-PCR系統（Corbett Research，澳大利亚）进行反应。根据SgGH19-1基因序列设计qRT-PCR引物SgGH19-1-RT-F/R（表1）。SgEF-1a作为柱花草的内参看家基因，qRT-PCR引物为SgEF-1a- RT-F/R（表1）。基因相对表达量=目的基因表达量/内参看家基因表达量。 1.2.4 SgGH19-1重组蛋白的表达与纯化 根据本实验室Chen等[17]已建立的方法，表达纯化GST：SgGH19-1融合重组蛋白。即：设计SgGH19- 1-GST-F/R引物（表1），通过PCR扩增获得SgGH19-1基因全长序列并克隆进PGEX-6P-3质粒（GE Healthcare，美国）的GST编码序列下游，构建成SgGH19-1-GST原核表达载体。将构建好的载体转入大肠杆菌BL21菌株。加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导GST：SgGH19-1蛋白在大肠杆菌中表达。收集菌体，用8 mL Binding buffer（140 mmol/L NaCl，2.7 mmol/L KCl，10 mmol/L Na2HPO4，1.8 mmol/L KH2PO4，Ph 7.3）重悬沉淀，并用超声波碎解菌体，离心后收集上清。上清与2 mL谷胱甘肽-琼脂糖凝胶（Glu t a thione Sepharose 4B;GE Healthcare，美国）在4 ℃下反应3 h，然后用Binding buffer洗脱3次，最后用Elution buffer（50 mmol/L Tris-HCl，10 mmol/L还原型谷胱甘肽，pH 8.0）洗脱目的蛋白。对纯化后的GST：SgGH19-1融合蛋白通过SDS-PAGE电泳分析蛋白纯度。
1.2.5 甲壳质酶活性测定 采用试剂盒（货号：CS0980;Sigma-Aldrich，美国）检测甲壳质酶活性。甲壳质外切酶和甲壳质内切酶活性测定底物分别为4-硝基苯基-β-D-N，N′-二乙酰壳二糖苷（4-Nitrophenyl N，N′-diacetyl-β-D-chitobioside）和4-硝基苯基-β-D-N，N′，N′′-三乙酰壳三糖苷（4-Ni tr ophenyl β-D-N，N′，N′′-triacetylchitotriose）。简要步骤如下：底物用醋酸钠缓冲液（50 mmol/L，pH 5.0）溶解至0.2 mg/mL;取适量酶蛋白液（约含1 μg蛋白）加入90 μL底物溶液中，并用醋酸钠缓冲液补足100 μL;样品混匀后在37 ℃反应30 min;加入100 μL碳酸钠溶液（0.4 mol/L）终止反应;混匀并静置2 min后测定OD405的吸光度值，以计算甲壳质酶催化底物降解释放的4-硝基苯酚;酶活力单位1 U表示1 min内转化1 μmol底物的酶量;酶活性用单位蛋白（mg）的酶活力单位（U）表示。
1.3 数据处理
通过SPSS18.0软件（IBM-SPSS，美国）对实验数据进行统计分析。数据可视化作图采用Microsoft Excel 2013软件（Microsoft，美国）。
2 结果与分析
2.1 柱花草PR-3同源基因的克隆及蛋白进化树分析
根据拟南芥、大豆、菜豆和蒺藜苜蓿PR-3同源基因的保守序列设计引物，通过PCR扩增获得了柱花草PR-3同源基因的414 bp EST序列（图1）。随后，以柱花草cDNA RACE文库为模板，根据获得的EST序列分别设计正、反向特异引物，并与通用引物配对扩增出柱花草PR-3同源基因的5′端与3′端序列（图1）。序列经拼接后，获得柱花草PR-3同源基因的开放阅读框（ORF）为984 bp（图1），共编码327个氨基酸。该基因序列已上传NCBI网站（accession number：MN064559），并将其命名为SgGH19-1。对SgGH19-1及拟南芥和水稻甲壳质酶蛋白的系统进化树分析如图2所示，植物的甲壳质酶可分为5个亚族，即ClassⅠ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ，其中ClassⅠ、Ⅱ和Ⅳ属于糖苷水解酶19家族（Glyco_hydro_19），而ClassⅢ和Ⅴ属于糖苷水解酶18家族（Glyco_hydro_18）。SgGH19-1与拟南芥PR-3同源性最高，属于Glyco_hydro_19的ClassⅠ亚族（图2）。
2.2 柱花草SgGH19-1基因响应炭疽菌侵染的表达模式分析
通过qRT-PCR分析SgGH19-1基因对炭疽菌侵染的响应，如图3所示，接种炭疽菌24 h后，SgGH19-1在柱花草叶片中的表达量比对照（0 h）提高2.4倍，差异显著（P<0.05）。随着炭疽菌侵染时间延長，SgGH19-1的表达量逐渐增加，并在接种72 h后达到最大值，表达量为0 h的7.1倍（P<0.05）（图3）。以上结果说明炭疽菌侵染诱导SgGH19-1基因上调表达。
2.3 胶孢炭疽菌侵染对柱花草叶片甲壳质酶活性的影响
如图4A所示，柱花草叶片的甲壳质内切酶活性在接种炭疽菌48 h后显著高于对照（0 h）（P<0.05），并随着接种时间延长酶活性逐渐增加，接种96 h后酶活性达到最大值，为0 h的4.0倍（P<0.05）。甲壳质外切酶活性在炭疽菌侵染72和96 h后均为对照（0 h）的2倍以上，差异显著（P<0.05）（图4B）。以上结果说明，炭疽菌侵染显著提高了柱花草叶片的甲壳质酶活性。
2.4 SgGH19-1蛋白的表达纯化及酶学特性分析
通过大肠杆菌原核表达系统表达SgGH19-1融合GST标签的重组蛋白，SDS-PAGE电泳分析如图5A所示，GST：SgGH19-1融合蛋白分子量约为61 kDa（SgGH19-1：35 kDa;GST：26 kDa），IPTG可诱导该蛋白表达（泳道2）。利用谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B分离纯化目标蛋白，经蛋白洗脱
不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。
液第2次洗脱获得较高纯度的GST：SgGH19-1蛋白，基本无杂蛋白污染（图5A，泳道4）。酶学性质分析表明，GST：SgGH19-1同时具有甲壳质内切酶与外切酶活性，但内切酶活性较高，为外切酶活性的9.1倍，差异显著（P<0.05）（图5B）。随后，分析了pH和温度对GST：SgGH19-1甲壳质内切酶活性的影响，结果表明GST：SgGH19-1的最适pH为5.0，最适温度为40 ℃（图6）。 3 讨论
植物病程相关蛋白PRs是一类受病原体或其他外界因子刺激诱导表达的蛋白质，在植物抗病性调节和适应逆境胁迫方面发挥着重要作用[11]。根据PRs蛋白的电泳迁移率、血清学关系和生物活性等，可将它们分为17类（PR-1～PR-17）[18]。其中，PR-3、PR-4、PR-8和PR-11属于甲壳质酶[19]。PR-3是植物中最早被鉴定具有甲壳质酶活性的病程相关蛋白[18]。目前，在烟草、拟南芥和菜豆等植物中已发现PR-3基因受病原菌侵染诱导增强表达[11]。本研究中，我们同源克隆了1个柱花草的PR-3基因，即SgGH19-1。接种炭疽菌后，柱花草叶片中SgGH19-1基因的表达水平显著提高，并且伴随着叶片甲壳质内切酶与外切酶活性的显著增加。这些结果表明，SgGH19-1对炭疽菌侵染存在响应，并参与了甲壳质酶活性调节，以此来增强柱花草的抗病性。与之类似，Wang等[14]的研究发现，接种炭疽菌后，柱花草中另外1个甲壳质酶基因Cht也显著增强表达。目前，植物中一些对病原菌侵染敏感响应的甲壳质酶基因，已被作为标记基因用于植物疾病的早期诊断，如水稻甲壳质酶用于对稻瘟病的快速检测[20]。
M：蛋白Marker（10～120 kDa）; A：SDS-PAGE分析大肠杆菌表达的GST：SgGH19-1蛋白;1：不加IPTG诱导的大肠杆菌总蛋白;2：加入IPTG诱导的大肠杆菌总蛋白;3：经洗脱1次纯化的SgGH19-1重组蛋白;4：经洗脱2次纯化的SgGH19-1重组蛋白。
B：SgGH19-1蛋白的酶活性分析，不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。
M： Protein Marker （10120 kDa）; A： SDS-PAGE analysis of GST：SgGH19-1 protein in E. coli. 1： Total E. coli protein without IPTG induction; 2： Total E. coli protein induced by IPTG; 3： Purified recombinant SgGH19-1 protein after once elution; 4： Purified recombinant SgGH19-1 protein after twiceelution. B： Enzyme activity analysis of SgGH19-1 protein， the different lowercase
SgGH19-1基因在接种炭疽菌24 h后就迅速上调表达，有潜力作为柱花草炭疽病检测的标记基因。
甲壳质酶在微生物（真菌、细菌和病毒）、动物和植物中已被广泛鉴定，根据蛋白结构特征，这些不同来源的甲壳质酶被分为糖苷水解酶18、19、23和48家族（Glyco_hydro_18/19/23/48）[21]。但目前植物中鉴定的甲壳质酶主要属于糖苷水解酶18家族和19家族，其中18家族包括Class Ⅲ和Ⅴ 2类甲壳质酶，而19家族包括ClassⅠ、Ⅱ和Ⅳ共3类甲壳质酶[10]。本研究鉴定的柱花草SgGH19-1属于糖苷水解酶19家族的ClassⅠ类甲壳质酶。虽然植物中不含甲壳质，但当受到病原真菌侵染时，植物会合成大量的甲壳质酶蛋白[22]。这主要是由于甲壳质酶能够水解真菌细胞壁中的甲壳质，破坏真菌细胞骨架，从而抑制真菌的致病力和生长发育，实现抗菌的生物学功能[11]。本研究中，我们成功在大肠杆菌中表达了SgGH19-1重组蛋白，并对纯化的蛋白进行了生化酶学性质分析，结果表明，SgGH19-1具有较强的甲壳质内切酶活性，即其能够作用于甲壳质内部的β-1，4-糖苷键，形成二乙酰壳二糖和可溶的低分子壳寡糖。此外，SgGH19-1同时也具有相對较弱的甲壳质外切酶活性，即其能够催化甲壳质从非还原性末端释放二乙酰壳二糖。这些结果暗示着，当受到炭疽菌侵染时，柱花草通过合成甲壳质酶，如SgGH19-1等，来抑制炭疽菌对宿主的侵害。蒋昌顺等[23]通过体外实验已经证明，水稻的甲壳质酶的粗提物能显著抑制柱花草胶孢炭疽菌的生长。
通过基因工程方法导入或者超量表达甲壳质酶编码基因，已被证明能够显著提高多种植物对真菌性病害的抗性，如：超量表达水稻的1个PR-3类甲壳质酶基因（chi11），显著增强了转基因水稻株系对纹枯病的抗性[24];在马铃薯中异源超量表达烟草的PR-3基因显著提高马铃薯对晚疫病的抗性[22];将水稻的2个几丁质酶基因（rcg3和rcc2）导入香蕉，能够显著降低黑条叶斑病菌（My c os phaerella fijiensis）对香蕉的侵染等[25]。综上所述，本研究从柱花草中鉴定了1个对炭疽菌侵染快速响应的甲壳质酶基因SgGH19-1，其编码的蛋白具有甲壳质内切酶与外切酶活性，该基因可作为柱花草抗炭疽病育种的候选基因资源。
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关键词 甲壳质;甲壳质酶;柱花草;蛋白纯化;酶学性质
中图分类号 S541 文献标识码 A
Cloning and Expression of a Chitinase Gene SgGH19-1 from Stylosanthes and Its Enzymatic Properties Analysis
LIU Pandao1， WU Xique2， LUO Jiajia1， XU Wenrong2*， LIU Guodao1*
1. Tropical Crops Genetic Resources Institute， Chinese Academy of Tropical Agriculture Sciences / Key Laboratory of Crop Gene Resources and Germplasm Enhancement in Southern China， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Haikou， Hainan 571101， China; 2. Department of Chemistry， School of Science， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China
Abstract Chitin is a major component of the cell wall of fungi， exoskeleton of insects， and crustacean shells. Chitinase is one of the main hydrolase that catalyzes the degradation of chitin. Induction of PR-3 chitinase protein accumulation is an adaptive mechanism for plants to enhance the resistance to fungal diseases. Stylo （Stylosanthes spp.） is an important tropical forage legume. Although anthracnose caused by Colletotrichum gloeosporioides is one of the most destructive fungal diseases of stylo， little information is available regarding the responses of stylo chitinase during the pathogen infection. In the study， the PR-3 chitinase of stylo was characterized， and its expression pattern and biochemical properties were also analyzed. The results showed that a chitinase gene of PR-3 group in stylo was the cloned by homologous gene sequence method， and its coding region was 984 bp. The gene belongs to the Class I chitinase of the glycoside hydrolase 19 family， and was named SgGH19-1. Quantitative PCR analysis showed that the expression level of SgGH19-1 gene in the leaves of stylo was significantly increased after C. gloeosporioides infection， and with the increase of chitinase activity. Subsequently， the recombinant protein of SgGH19-1 was expressed and purified in Escherichia coli. Biochemical properties of SgGH19-1 showed both exochitinase and endochitinase activities， and the activities of endochitinase was 9.1 fold higher than that of exochitinase. Furthermore， the optimum pH and temperature for SgGH19-1 activity was 5.0 and 40 ℃ respectively. Taken together， SgGH19-1 is a chitinase that involved in the response of stylo to C. gloeosporioides attack. These results herein suggest that SgGH19-1 could potentially be employed as a new marker gene for developing cultivars of stylo with great tolerance to anthracnose. Keywords chitin; chitinase; Stylosanthes; protein purification; enzymatic property
DOI 10.3969/j.issn.1000-2561.2019.12.014
甲壳质（chitin），又名甲壳素、几丁质，是由N-乙酰-D-氨基葡萄糖（GlcNAc）以β-1，4糖苷键连接而成的天然高分子化合物[1]。甲壳质普遍存在于真菌的细胞壁、蟹虾和贝类等甲壳动物的外壳以及昆虫的外骨骼等[2]。据估计，在自然界中甲壳质的生物合成量每年超过千亿吨，是仅次于纤维素的第二大天然生物质资源[3]。近年来，由甲壳质及其脱乙酰产物壳聚糖（chitosan）降解后产生的衍生物，被用于化工、食品、制药、材料科学和农业等众多领域，具有广阔的应用前景[4-5]。但是目前对甲壳质的降解主要采用化学方法，几乎都要用到强酸、强碱，对环境污染大，且产物分子量不均匀[6]。利用生物酶学方法降解甲壳质具有专一性强、酶解效率高和环保等优点，因此是替代化学方法的理想技术，正受到越来越多的关注[7]。
甲壳质的生物酶解主要通过甲壳质酶（chitinase），也被称为甲壳素酶或几丁质酶。甲壳质酶是一种能够催化甲壳质的β-1，4糖苷键裂解产生N-乙酰葡萄糖胺寡聚体的水解酶类[8]。目前，甲壳质酶已经在细菌、真菌、动物和植物中被广泛鉴定，并根据其对底物的切割位点不同，被分为甲壳质外切酶（exochitinase）和甲壳质内切酶（endochitinase）[9-10]。在植物中，从拟南芥、烟草和菜豆等中鉴定到一类受病原菌诱导表达的PR-3蛋白，它们具有甲壳质酶活性，属于病程相关蛋白（pathogenesis-related proteins， PRs），如拟南芥的AtPR-3，这些甲壳质酶蛋白的主要作用是当植物受到病原菌侵害时，水解真菌细胞壁中的甲壳质，具有抗真菌作用[11]。
柱花草（Stylosanthes spp.）是一种热带和亚热带地区重要的豆科牧草与绿肥植物，可用作饲草、果园覆盖、水土保持和间作等[12]。由真菌类病原菌胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）引起的炭疽病是危及柱花草生产的主要病害[13]。目前，柱花草中PR-3类甲壳质酶基因对炭疽菌侵染的响应仍不清楚。本研究将通过分子生物学方法，同源克隆柱花草PR-3类甲壳质酶基因，并对该基因编码的蛋白进行表达、纯化和生化酶学性质分析，以期解析甲壳质酶在柱花草抗炭疽病过程中发挥的作用。
1 材料与方法
1.1 材料
本研究所用的热研2号柱花草（Stylosanthes guianensis cv. Reyan 2）和胶孢炭疽菌由中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所草业研究室提供。
1.2 方法
1.2.1 柱花草炭疽菌接种 柱花草种子经80 ℃热水浸泡2 min后，播种于装有基质（腐殖土∶蛭石=1∶1）育苗盒中，每3 d浇一次1/2 Hoagland营养液。幼苗培养1个月后，参照Wang等[14]的方法，制备炭疽菌孢子悬浮液并接种柱花草幼苗，简要实验步骤如下：配制马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基，划板接种胶孢炭疽菌，28 ℃暗培养10 d，无菌水洗脱孢子，控制孢子浓度在106个/mL，并加入0.2% Tween-20。接种室温度28 ℃，湿度90%以上，用孢子悬浮液喷洒柱花草幼苗叶片至凝成水珠。分别在接种0、24、48、72、96 h后收取叶片材料用于测定相关指标。
1.2.2 柱花草PR-3同源基因的克隆与进化树分析 柱花草PR-3同源基因的克隆参照Liu等[15]的方法。首先，对不同植物中的PR-3基因进行多序列比对，包括拟南芥（Arabidopsis thaliana）的At3G12500（AtPR-3）、大豆（Glycine max）的Glyma02g04820、蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）的Medtr8g074330和菜豆（Phaseolus vulgaris）的Phvul.003G268500。根据这些基因的保守序列设计同源克隆引物SgPR-3-EST-F/R（表1），以热研2号柱花草的cDNA为模板，通过PCR扩增及测序获得柱花草PR-3同源基因的EST片段序列。随后，采用的SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit试剂盒（Clotech，美国）扩增柱花草PR-3基因的5′末端和3′末端。即根据获得的EST序列分别设计正向和反向引物SgPR-3-5′RACE-R和SgPR-3-3′RACE-F，分别与试剂盒中的通用引物RACE-UPM和RACE-NUP（表1）配对，通过RACE扩增得到5′和3′端序列，拼接后获得柱花草PR-3基因的cDNA全长序列，并用引物SgPR-3-ORF- F/R（表1）扩增全长序列。基因多序列比对、氨基酸序列比对和进化树构建分别采用DNAMAN、Clustal X和MEGA 5软件。根据同源比对结果，将柱花草PR-3基因命名为SgGH19-1。
1.2.3 SgGH19-1基因的表达模式分析 参照刘攀道等[16]的荧光定量PCR（qRT-PCR）方法分析SgGH19-1基因的表达模式。即：柱花草总RNA提取采用TRIzol试剂盒（Invitrogen，美国）;cDNA第1链合成采用M-MLV反转录酶试剂盒（Promega，美国）;qRT-PCR分析运用SYBR Green（TaKaRa，日本）试剂盒在Rotor-Gene 3000 qRT-PCR系統（Corbett Research，澳大利亚）进行反应。根据SgGH19-1基因序列设计qRT-PCR引物SgGH19-1-RT-F/R（表1）。SgEF-1a作为柱花草的内参看家基因，qRT-PCR引物为SgEF-1a- RT-F/R（表1）。基因相对表达量=目的基因表达量/内参看家基因表达量。 1.2.4 SgGH19-1重组蛋白的表达与纯化 根据本实验室Chen等[17]已建立的方法，表达纯化GST：SgGH19-1融合重组蛋白。即：设计SgGH19- 1-GST-F/R引物（表1），通过PCR扩增获得SgGH19-1基因全长序列并克隆进PGEX-6P-3质粒（GE Healthcare，美国）的GST编码序列下游，构建成SgGH19-1-GST原核表达载体。将构建好的载体转入大肠杆菌BL21菌株。加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导GST：SgGH19-1蛋白在大肠杆菌中表达。收集菌体，用8 mL Binding buffer（140 mmol/L NaCl，2.7 mmol/L KCl，10 mmol/L Na2HPO4，1.8 mmol/L KH2PO4，Ph 7.3）重悬沉淀，并用超声波碎解菌体，离心后收集上清。上清与2 mL谷胱甘肽-琼脂糖凝胶（Glu t a thione Sepharose 4B;GE Healthcare，美国）在4 ℃下反应3 h，然后用Binding buffer洗脱3次，最后用Elution buffer（50 mmol/L Tris-HCl，10 mmol/L还原型谷胱甘肽，pH 8.0）洗脱目的蛋白。对纯化后的GST：SgGH19-1融合蛋白通过SDS-PAGE电泳分析蛋白纯度。
1.2.5 甲壳质酶活性测定 采用试剂盒（货号：CS0980;Sigma-Aldrich，美国）检测甲壳质酶活性。甲壳质外切酶和甲壳质内切酶活性测定底物分别为4-硝基苯基-β-D-N，N′-二乙酰壳二糖苷（4-Nitrophenyl N，N′-diacetyl-β-D-chitobioside）和4-硝基苯基-β-D-N，N′，N′′-三乙酰壳三糖苷（4-Ni tr ophenyl β-D-N，N′，N′′-triacetylchitotriose）。简要步骤如下：底物用醋酸钠缓冲液（50 mmol/L，pH 5.0）溶解至0.2 mg/mL;取适量酶蛋白液（约含1 μg蛋白）加入90 μL底物溶液中，并用醋酸钠缓冲液补足100 μL;样品混匀后在37 ℃反应30 min;加入100 μL碳酸钠溶液（0.4 mol/L）终止反应;混匀并静置2 min后测定OD405的吸光度值，以计算甲壳质酶催化底物降解释放的4-硝基苯酚;酶活力单位1 U表示1 min内转化1 μmol底物的酶量;酶活性用单位蛋白（mg）的酶活力单位（U）表示。
1.3 数据处理
通过SPSS18.0软件（IBM-SPSS，美国）对实验数据进行统计分析。数据可视化作图采用Microsoft Excel 2013软件（Microsoft，美国）。
2 结果与分析
2.1 柱花草PR-3同源基因的克隆及蛋白进化树分析
根据拟南芥、大豆、菜豆和蒺藜苜蓿PR-3同源基因的保守序列设计引物，通过PCR扩增获得了柱花草PR-3同源基因的414 bp EST序列（图1）。随后，以柱花草cDNA RACE文库为模板，根据获得的EST序列分别设计正、反向特异引物，并与通用引物配对扩增出柱花草PR-3同源基因的5′端与3′端序列（图1）。序列经拼接后，获得柱花草PR-3同源基因的开放阅读框（ORF）为984 bp（图1），共编码327个氨基酸。该基因序列已上传NCBI网站（accession number：MN064559），并将其命名为SgGH19-1。对SgGH19-1及拟南芥和水稻甲壳质酶蛋白的系统进化树分析如图2所示，植物的甲壳质酶可分为5个亚族，即ClassⅠ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ，其中ClassⅠ、Ⅱ和Ⅳ属于糖苷水解酶19家族（Glyco_hydro_19），而ClassⅢ和Ⅴ属于糖苷水解酶18家族（Glyco_hydro_18）。SgGH19-1与拟南芥PR-3同源性最高，属于Glyco_hydro_19的ClassⅠ亚族（图2）。
2.2 柱花草SgGH19-1基因响应炭疽菌侵染的表达模式分析
通过qRT-PCR分析SgGH19-1基因对炭疽菌侵染的响应，如图3所示，接种炭疽菌24 h后，SgGH19-1在柱花草叶片中的表达量比对照（0 h）提高2.4倍，差异显著（P<0.05）。随着炭疽菌侵染时间延長，SgGH19-1的表达量逐渐增加，并在接种72 h后达到最大值，表达量为0 h的7.1倍（P<0.05）（图3）。以上结果说明炭疽菌侵染诱导SgGH19-1基因上调表达。
2.3 胶孢炭疽菌侵染对柱花草叶片甲壳质酶活性的影响
如图4A所示，柱花草叶片的甲壳质内切酶活性在接种炭疽菌48 h后显著高于对照（0 h）（P<0.05），并随着接种时间延长酶活性逐渐增加，接种96 h后酶活性达到最大值，为0 h的4.0倍（P<0.05）。甲壳质外切酶活性在炭疽菌侵染72和96 h后均为对照（0 h）的2倍以上，差异显著（P<0.05）（图4B）。以上结果说明，炭疽菌侵染显著提高了柱花草叶片的甲壳质酶活性。
2.4 SgGH19-1蛋白的表达纯化及酶学特性分析
通过大肠杆菌原核表达系统表达SgGH19-1融合GST标签的重组蛋白，SDS-PAGE电泳分析如图5A所示，GST：SgGH19-1融合蛋白分子量约为61 kDa（SgGH19-1：35 kDa;GST：26 kDa），IPTG可诱导该蛋白表达（泳道2）。利用谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B分离纯化目标蛋白，经蛋白洗脱
不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。
液第2次洗脱获得较高纯度的GST：SgGH19-1蛋白，基本无杂蛋白污染（图5A，泳道4）。酶学性质分析表明，GST：SgGH19-1同时具有甲壳质内切酶与外切酶活性，但内切酶活性较高，为外切酶活性的9.1倍，差异显著（P<0.05）（图5B）。随后，分析了pH和温度对GST：SgGH19-1甲壳质内切酶活性的影响，结果表明GST：SgGH19-1的最适pH为5.0，最适温度为40 ℃（图6）。 3 讨论
植物病程相关蛋白PRs是一类受病原体或其他外界因子刺激诱导表达的蛋白质，在植物抗病性调节和适应逆境胁迫方面发挥着重要作用[11]。根据PRs蛋白的电泳迁移率、血清学关系和生物活性等，可将它们分为17类（PR-1～PR-17）[18]。其中，PR-3、PR-4、PR-8和PR-11属于甲壳质酶[19]。PR-3是植物中最早被鉴定具有甲壳质酶活性的病程相关蛋白[18]。目前，在烟草、拟南芥和菜豆等植物中已发现PR-3基因受病原菌侵染诱导增强表达[11]。本研究中，我们同源克隆了1个柱花草的PR-3基因，即SgGH19-1。接种炭疽菌后，柱花草叶片中SgGH19-1基因的表达水平显著提高，并且伴随着叶片甲壳质内切酶与外切酶活性的显著增加。这些结果表明，SgGH19-1对炭疽菌侵染存在响应，并参与了甲壳质酶活性调节，以此来增强柱花草的抗病性。与之类似，Wang等[14]的研究发现，接种炭疽菌后，柱花草中另外1个甲壳质酶基因Cht也显著增强表达。目前，植物中一些对病原菌侵染敏感响应的甲壳质酶基因，已被作为标记基因用于植物疾病的早期诊断，如水稻甲壳质酶用于对稻瘟病的快速检测[20]。
M：蛋白Marker（10～120 kDa）; A：SDS-PAGE分析大肠杆菌表达的GST：SgGH19-1蛋白;1：不加IPTG诱导的大肠杆菌总蛋白;2：加入IPTG诱导的大肠杆菌总蛋白;3：经洗脱1次纯化的SgGH19-1重组蛋白;4：经洗脱2次纯化的SgGH19-1重组蛋白。
B：SgGH19-1蛋白的酶活性分析，不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。
M： Protein Marker （10120 kDa）; A： SDS-PAGE analysis of GST：SgGH19-1 protein in E. coli. 1： Total E. coli protein without IPTG induction; 2： Total E. coli protein induced by IPTG; 3： Purified recombinant SgGH19-1 protein after once elution; 4： Purified recombinant SgGH19-1 protein after twiceelution. B： Enzyme activity analysis of SgGH19-1 protein， the different lowercase
SgGH19-1基因在接种炭疽菌24 h后就迅速上调表达，有潜力作为柱花草炭疽病检测的标记基因。
甲壳质酶在微生物（真菌、细菌和病毒）、动物和植物中已被广泛鉴定，根据蛋白结构特征，这些不同来源的甲壳质酶被分为糖苷水解酶18、19、23和48家族（Glyco_hydro_18/19/23/48）[21]。但目前植物中鉴定的甲壳质酶主要属于糖苷水解酶18家族和19家族，其中18家族包括Class Ⅲ和Ⅴ 2类甲壳质酶，而19家族包括ClassⅠ、Ⅱ和Ⅳ共3类甲壳质酶[10]。本研究鉴定的柱花草SgGH19-1属于糖苷水解酶19家族的ClassⅠ类甲壳质酶。虽然植物中不含甲壳质，但当受到病原真菌侵染时，植物会合成大量的甲壳质酶蛋白[22]。这主要是由于甲壳质酶能够水解真菌细胞壁中的甲壳质，破坏真菌细胞骨架，从而抑制真菌的致病力和生长发育，实现抗菌的生物学功能[11]。本研究中，我们成功在大肠杆菌中表达了SgGH19-1重组蛋白，并对纯化的蛋白进行了生化酶学性质分析，结果表明，SgGH19-1具有较强的甲壳质内切酶活性，即其能够作用于甲壳质内部的β-1，4-糖苷键，形成二乙酰壳二糖和可溶的低分子壳寡糖。此外，SgGH19-1同时也具有相對较弱的甲壳质外切酶活性，即其能够催化甲壳质从非还原性末端释放二乙酰壳二糖。这些结果暗示着，当受到炭疽菌侵染时，柱花草通过合成甲壳质酶，如SgGH19-1等，来抑制炭疽菌对宿主的侵害。蒋昌顺等[23]通过体外实验已经证明，水稻的甲壳质酶的粗提物能显著抑制柱花草胶孢炭疽菌的生长。
通过基因工程方法导入或者超量表达甲壳质酶编码基因，已被证明能够显著提高多种植物对真菌性病害的抗性，如：超量表达水稻的1个PR-3类甲壳质酶基因（chi11），显著增强了转基因水稻株系对纹枯病的抗性[24];在马铃薯中异源超量表达烟草的PR-3基因显著提高马铃薯对晚疫病的抗性[22];将水稻的2个几丁质酶基因（rcg3和rcc2）导入香蕉，能够显著降低黑条叶斑病菌（My c os phaerella fijiensis）对香蕉的侵染等[25]。综上所述，本研究从柱花草中鉴定了1个对炭疽菌侵染快速响应的甲壳质酶基因SgGH19-1，其编码的蛋白具有甲壳质内切酶与外切酶活性，该基因可作为柱花草抗炭疽病育种的候选基因资源。
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