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摘要 [目的]研究酸奶制作时保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的分离纯化、发酵性能、添加比例。[方法]使用选择性培养基分离出保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌，并对其发酵性能和传代特性进行测定，最终选择出发酵性能较好的保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌；将分离出来的保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌以不同比例在脱脂乳中进行混合菌株发酵，确定制作酸奶时两者的最佳添加比例。[结果]在酸奶发酵时，保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的添加比例为1∶1时，发酵脱脂乳粉可以在4 h内凝乳，发酵产品活菌数为5.4×107 CFU/ mL，酸度达到78.1°T，pH為4.50，发酵性能较好。[结论]该研究为乳酸菌在实际生产中更好的应用提供理论。
关键词 保加利亚乳杆菌；嗜热链球菌；分离纯化；菌种搭配；添加比例
中图分类号 TS252.54 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2018）17-0179-04
Abstract [Objective] The research aimed to study the separation， purification， fermentation performance and addition ratio of Lactobacillus bulgaricus and Streptococcus thermophilus when making yogurt. [Method] Lactobacillus bulgaricus and Streptococcus thermophilus were isolated by selective medium， and their fermentation performance and passaging characteristics were determined. Finally， Lactobacillus bulgaricus and Streptococcus thermophilus with good fermentation performance were selected.The isolated Lactobacillus bulgaricus and Streptococcus thermophilus were mixed fermented in skim milk in different ratios， and the optimum addition ratio of the two was determined.[Result]During the fermentation of yoghurt， when the ratio of Lactobacillus bulgaricus and Streptococcus thermophilus was 1∶1， the fermented skim milk powder could be curd within 4 h， the viable cell count of the fermented product was 5.4×107 CFU/ mL， and the acidity reaches 78.1 °T， pH was 4.50， and the fermentation performance was better.[Conclusion]This study provides a theoretical basis for better application of Lactobacillus in actual production.
Key words Lactobacillus bulgaricus；Streptococcus thermophilus；Separation and purification；Matching of bacteria；Proportion of addition
保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus）和嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）是乳酸菌类的益生菌，也是人体肠道中的重要微生物，二者作为发酵乳制品重要的发酵剂菌种而被广泛应用，具有较高的经济价值和研究价值[1]。菌种的选择和发酵剂的制备不仅影响酸奶和发酵乳饮料的产品质量，而且还直接影响酸奶和发酵乳饮料的产量与经济效益[2]。有研究表明，保加利亚乳杆菌与嗜热链球菌存在互惠共生作用，将不同的乳酸菌进行组合可以发挥其不同的发酵性能[3]。因此，选择发酵性能好的保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌，并掌握生产优质酸奶和发酵乳饮料的最佳添加比例是一个关键。
普通乳酸菌发酵剂的特点是菌种纯正，发酵性能稳定，发酵产物除了乳酸外，还有一定量的风味物质、维生素、抗菌物质等[4]。该试验采用梯度稀释涂布法从酸奶中分离纯化
乳酸菌，选择出发酵性能好的保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌，将分离出来的保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌以不同比例在脱脂乳中进行混合菌株发酵，依据发酵性能确定制作酸奶时保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的最佳添加比例，为其在实际生产中更好的应用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试剂。MRS固体培养基[5]；M17固体培养基[6]；复原脱脂乳培养基（菌种培养用）；灭菌生理盐水（梯度稀释用）；酚酞指示剂。
1.1.2 仪器与设备。
试管、移液管、培养皿、玻璃棒、玻璃珠、烧杯、三角瓶、载玻片、碱式滴定管、量筒、温度计，具体型号规格和厂家见表1。
1.2 方法
1.2.1 基本工艺设计路线。
菌种分离纯化→菌种的搭配→菌种的传代→确定最终菌株及添加比例。最终依据发酵性能选择一种比较好的普通乳酸菌发酵剂配方，发酵性能的好坏主要通过酸度和pH的测定。 1.2.2 菌种的分离。
首先，将市售的酸奶样品进行涂片、美蓝染色镜检观察，确定样品中发酵剂含有保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌。然后用一支10 mL无菌移液管吸取10 mL酸奶样品，放入盛有90 mL无菌水并带有玻璃珠的三角瓶中，用微型旋涡混合器振摇30 s左右，使酸奶样品与无菌水充分混合，将细菌分散。用一支1 mL无菌移液管吸取1 mL酸奶悬液，加入盛有9 mL无菌水的试管中充分混匀，再用一支无菌移液管从此试管中吸取1 mL加入另一盛有9 mL无菌水的试管中，混合均匀，以此类推制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5不同稀释度的酸奶溶液（注意：操作时管尖不能接触液面，每一个稀释度换一支试管和移液管）。最后，取6个倒入MRS固体培养基的培养皿分别贴上10-3、10-4、10-5 3个稀释度各2个标签，用无菌吸管分别由10-3、10-4、10-5 3管酸奶稀释液中吸取0.5 mL，小心地滴在对应平板培养皿表面中央位置。用无菌玻璃棒涂匀，右手拿无菌涂棒平放在平板培养基表面上，将菌悬液先沿同心圆方向轻轻向外扩展，使之分布均匀。室温下静置5～10 min，使菌液浸入培养基。同样的操作加入M17固体培养基再做1次。
将培养皿放在37.5 ℃的数显电热培养箱中培养48 h后，挑起单个典型菌落进行镜检，以确保是否是单菌的菌落，若不是则反复进行以上操作，直至得到单菌落；反之则进行下一步的试验。
1.2.3 菌种的纯化。
挑选典型的球菌和杆菌的单个菌落接种于脱脂乳中增菌复壮培养，然后再进行平板分离，每个平板一般挑选5～7个典型菌落，凝固后镜检，检验脱脂乳中是否有杆菌或球菌的增殖，剔除含污染菌的发酵管，选取较纯的发酵乳管再经梯度稀释，涂布平板培养，以进一步纯化，并用脱脂乳发酵做凝乳试验并滴定酸度，选取发酵性能好的杆菌和球菌。
1.2.4 菌种的搭配。
分别在50 mL脱脂乳（经过保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌凝乳发酵）中接入菌种，总接种量为3%，两菌之比为1∶1，在42.5 ℃的数显电热培养箱中进行发酵培养。根据发酵特性，选出发酵效果较好、凝乳时间较短的组合。
1.2.5 菌种的传代和稳定性测试。
将挑选出来的发酵性能较好的保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌进行传代，用以检测菌种的稳定性。每次取3%的接种量加入到50 mL无菌的脱脂乳中，在42.5 ℃的数显电热培养箱中进行发酵培养直至刚好凝乳，记录凝乳时间，并测定pH和酸度。通过各项指标确定菌种的稳定性。
1.2.6 菌种的比例搭配。
将挑选出发酵效果好的组合，分别再次接入无菌的脱脂乳中（按照保加利亚乳杆菌和嗜熱链球菌的比例为1.0∶1.0、1.0∶1.5、1.0∶2.0、2.0∶1.0、1.5∶1.0，总接种量为3%），在42.5 ℃的条件下进行发酵，凝乳后停止，进行美蓝染色并在显微镜下镜检，观察凝乳后的脱脂乳中球菌和杆菌的比例。通过测定凝乳时间、酸度、pH等指标来确定保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的最适添加比例。
1.3 检测项目
1.3.1 酸度的测定。
采用滴定酸度法，以吉尔涅尔度表示（°T）。取10 mL牛乳，用20 mL蒸馏水稀释，加入0.5%的酚酞指示剂0.5 mL，以0.1 mol/L溶液滴定，将所消耗的NaOH毫升数乘以10，即为中和100 mL牛乳所需的0.1 mol/L NaOH毫升数，每毫升为1°T，也称1度[7]。
1.3.2 pH的测定。
采用两点校正法，用实验室pH计直接测定。
1.3.2.1 酸度计的校正。将电极放入缓冲液中，并按校准键，开始校准，校准和测量图标将同时显示，在信号稳定后，仪表根据预选终点方式终点或按度数键终点。再用去离子水冲洗电极，将电极放入下一个校准缓冲液中，并按校准键开始下一点校准。
1.3.2.2
样液的测定。用无CO2蒸馏水淋洗电极，并用滤纸吸干，再用待测样液冲洗电极，将电极插入待测样液中，按下度数开关，稳定1 min后，酸度计所显示的数值即为待测样液的pH。
1.3.3 凝乳时间的测定。
每次接种后的脱脂乳粉应放入42.5 ℃的电热恒温培养箱中培养，直至凝乳后取出，记录时间。凝乳后的脱脂乳粉应放在4 ℃的条件下保存。
1.3.4 菌种比例情况。通过显微镜涂片观察。
2 结果与分析
2.1 保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的筛选
嗜热链球菌在M17固体培养基上生长，形成卵圆形，表面光滑的黄色凸起菌落，菌落较大，菌落直径为1～2 mm。由于pH 7.1不适合保加利亚乳杆菌的生长，所以M17固体培养基上基本没有保加利亚乳杆菌，或形成模糊不清的羊毛状菌落，易与嗜热链球菌分开。
保加利亚乳杆菌在MRS固体培养基上生长，形成形状不规则、表面粗糙的白色凸起菌落，菌落直径为1～3 mm。由于5.4的pH不适合嗜热链球菌的生长，所以MRS固体培养基上基本没有嗜热链球菌的菌落。
通过美蓝染色在显微镜下观察，嗜热链球菌呈卵圆形，单个细菌直径为0.7～0.9 μm，多个细菌组织形态一般成对或形成长链状，无运动性。保加利亚乳杆菌无运动性，两端钝圆，细杆状，多个细菌成单或成链，单个细菌在乳中长度是0.9～5.0 μm。
2.2 保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的特性测定
分别挑取分离出的保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的菌落各10株，经复原脱脂乳初次培养，筛选出性能较好的4株球菌、2株杆菌，再分别以3%接入质量分数为10%复原脱脂乳培养基，42.5 ℃发酵至凝乳，观察记录凝乳时间、滴定酸度和pH。
从表2可以看出，4株球菌和2株杆菌的pH终点在5%水平上差异均不显著。杆菌2的pH最大，球菌4的最小。 而滴定酸度球菌3的数值最大，球菌2的数值最小，它们之间存在着4.1°T的差异，且最小的滴定酸度66.9°T也满足生产酸奶的需要。在酸度上，球菌1、杆菌2与球菌3、杆菌1差异显著，球菌2与球菌3、球菌4、杆菌1差异也显著。由此可见，以上各株菌种产酸活性都可以达到发酵性能优良的要求，所以这6株都可以作为发酵剂的菌株来使用。
2.3 保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的搭配发酵试验
酸奶是由保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌共同发酵产生的，两者具有良好的相互促进生长的关系，两者在一起的产酸速度高于两者之中单一的产酸速度。保加利亚乳杆菌经代谢活动，分解乳蛋白质产生不同的代谢物质，主要是肽类和氨基酸类物质，如甘氨酸和组氨酸等作为刺激因素，促进了嗜热链球菌的生长；同样，嗜热链球菌在生长过程中产生的一些物质，主要是甲酸类化合物，促进了保加利亚乳杆菌的生长。
选取发酵活力高的球菌（球菌1、球菌2、球菌3、球菌4）和杆菌（杆菌1、杆菌2），将保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌组合起来进行搭配试验。发酵温度为42.5 ℃，总接种量为3%，起始pH相同，且杆菌与球菌的比例为1∶1。试验数据如表3所示。
比较表2和表3发现，在相同的凝乳条件下，杆菌1与各个球菌组合的混菌的凝乳时间比单一的杆菌1的凝乳时间多0.5 h，杆菌1+球菌3的pH终点（4.84）比杆菌1的pH终点（4.79）大0.05。杆菌2与各个球菌组合的混菌的凝乳时间比单一杆菌的凝乳时间缩短了0.5 h。从酸度上看，杆菌2与4株球菌的搭配都大于杆菌2单独发酵的酸度。造成以上现象的原因是与不同的杆菌和球菌生长动力学特异性有关。从pH上看，4种球菌和2种杆菌搭配之间差异均不显著。从滴定酸度上看，杆菌2+球菌3、杆菌2+球菌4差异不显著。从整体上来看，pH较好的为杆菌2+球菌1、杆菌2+球菌2，数值分别为4.69、4.70；滴定酸度较好的为杆菌2+球菌1、杆菌2+球菌2，分别为75.2、73.1 °T。所以选择杆菌2和球菌1、球菌2的组合搭配。
通过对杆菌2+球菌1、杆菌2+球菌2两组发酵乳涂片，并在显微镜下观察发现杆菌与球菌的比例约为1∶1。
2.4 菌种的传代试验
所谓菌种退化，主要是指生产菌或选育过程中筛选出来的较优良菌株，由于菌种进行接种传代或保藏之后，会出现群体中的某些生理特征和形态特征逐渐减退或完全丧失的现象[8]。集中表现在目的代谢物合成能力降低，产量下降。
菌种活性退化会对以后生产酸奶的过程有影响，菌种活性退化严重将限制以后生产酸奶时菌种的使用时间和次数，所以应对杆菌2和球菌1、球菌2做传代试验，研究这3株菌和杆菌与球菌搭配的2种混菌产酸活性退化是否严重。发酵條件是温度37.5 ℃，接种量3%，混菌发酵杆菌与球菌比例为1∶1，起始pH相同。
从表4可以看出，杆菌2传代前2次的pH相同，不存在显著差异，从第3代起pH具有显著性差异，滴定酸度与pH终点的变化差异基本相同，具有相同的趋势。从整体上来看，不论是pH终点还是滴定酸度都存在显著性变化，所以杆菌2有退化的现象。
从2株球菌的传代数据（表5）来看，随着传代次数的增加，其pH终点和滴定酸度都发生了显著性变化，但由于在第5代时2个菌种的滴定酸度还可以稳定在60°T左右，表明它们的稳定性比杆菌2好。这可能是由于杆菌的细胞大，在传代过程中易变形所致。菌种退化不是突然变化的，而是从量变到质变的逐步演变的过程。开始时，在群体细胞中仅出现产量下降的个别突变细胞，不会使群体菌株性能明显改变。经过连续传代，负变细胞达到一定数量，在群体中占了优势，从整体菌株上反映产量下降及其相关的一些特性发生了变化，表现上便出现了退化。
从混菌发酵的传代数据（表6）可以看出，比较杆菌2与球菌1和球菌2的搭配菌种活性退化趋势与单菌种的退化趋势发现，混菌的传代稳定性较好，主要是pH和酸度的数值变化不大，传代5次与第1次的pH和酸度相差不大。所以杆菌2+球菌1、杆菌2+球菌2的传代性能较好。
分别对杆菌2+球菌1、杆菌2+球菌2的每一代进行涂片观察，发现在前2代杆菌与球菌的比例为1.0∶1.0～1.5∶1.0，随着传代次数的增加，杆菌所占的比例不断增大。
2.5 保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的搭配比例试验
对于酸奶良好风味的形成，嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌在发酵过程中要保持大约相同的数量。当酸度到达一定程度，球菌不再生长，相对而言，杆菌较为耐酸。球菌和杆菌的菌株特性必须要相互适配，并不是所有菌株的配合都是适宜的。
球菌和杆菌的比例在不断变化，起始时由于杆菌产生的刺激因子，球菌生长较快，之后由于酸的积累，球菌生长缓慢；后来，由于球菌产生的甲酸和二氧化碳，杆菌快速生长，最后两者比例达到初始发酵时的比例，接种量增大会加快产酸速度，这样很快会使球菌生长停止，导致杆菌比例增高（在相同培养时间情况下）；接种量少，则相反。所以该试验对杆菌和球菌进行了比例搭配试验，试验相关数据如表7所示。发酵的条件是温度42.5 ℃，总接种量3%，起始pH相同。
从表7可以看出，杆菌2与球菌1和球菌2以1.0∶1.0、1.0∶1.5、1.0∶2.0、2.0∶1.0、1.5∶1.0的比例搭配时，pH均没有显著差异，杆菌2和球菌1、球菌2搭配的滴定酸度是有显著性的。当杆菌2与球菌1混合时，比例为1.0∶1.0时，它的滴定酸度是最大的，且pH最小；比例以1.0∶1.5混合时，滴定酸度次之。杆菌2与球菌1、球菌2在以2.0∶1.0混合时，滴定酸度均是同条件下不同菌种比例时的最低。另外保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的比例是1.0∶1.0时乳凝固状态最好，故当保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的比例是1.0∶1.0时两菌共生效果较好，发酵酸奶时用此比例更适合。
对保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌之比为1.0∶1.0且凝乳状态最好的酸奶采用平板菌落计数法，测得活菌数为5.4×107CFU/mL。 3 结论
通过对保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的特性测定，选择出2株杆菌、4株球菌，它们的pH为4.73～4.83，酸度为66.9～71.1°T。
通过将杆菌1、杆菌2分别与球菌1、2、3、4按1∶1（总接种量为3%）的比例搭配发酵，选择出凝乳时间均为4 h的杆菌2+球菌1、杆菌2+球菌2的两组搭配，pH分别为4.69、4.70，酸度分别为75.2、73.1°T。
通过对保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的搭配比例试验，得出保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌之比为1∶1时，两菌共生效果好，更适合酸奶发酵。
综上所述，保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的添加比例为1∶1时，发酵脱脂乳粉可以在4 h内凝乳，发酵产品活菌数为5.4×107 CFU/mL，酸度达78.1°T，pH为4.50，发酵性能较好。
参考文献
[1] CRITTENDEN R G，MARTINEZ N R，PLAYNE M J.Synthesis and utilisation offolate by yoghurt starter cultures and probiotic bacteria[J].International journal of food microbiology，2003，80（3）：217-222.
[2] 田洪濤，万红兵，刘宽庆，等.酸奶冻干发酵剂制备中保加利亚乳杆菌不同菌株特性的研究[J].中国乳品工业，2006，34（12）：4-6.
[3] SKRIVER A，STENBY E，FOLKENBERG D M，et al.Tools in the development of future starter cultures for fermented milk[M]//Proceedings of the IDF seminar on aroma and texture of fermented milk.Brussels，Belgium：International Dairy Federation，2003：55-61.
[4] 乔发东，吴秀芳，南庆贤，等.浓缩乳酸菌发酵剂的现状[J].中国乳品工业，1998，26（1）：22-23.
[5] 吴定，孙德坤，解光艳，等.乳酸菌的分离、鉴定和驯化[J].安徽农业技术师范学院学报，2000，14（1）：5-7.
[6] VINDEROLA C G，REINHEIMER J A.Culture media for the enumeration of Bifidobacterium bifidum and Lactobacillus acidophilus in the presence of yoghurt bacteria[J].International dairy journal，1999，9：497-505.
[7] 张和平，张佳程.乳品工艺学[M].北京：中国轻工业出版社，2009：425.
[8] 余龙江.发酵工程原理与技术应用[M].北京：化学工业出版社，2006：39.
关键词 保加利亚乳杆菌；嗜热链球菌；分离纯化；菌种搭配；添加比例
中图分类号 TS252.54 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2018）17-0179-04
Abstract [Objective] The research aimed to study the separation， purification， fermentation performance and addition ratio of Lactobacillus bulgaricus and Streptococcus thermophilus when making yogurt. [Method] Lactobacillus bulgaricus and Streptococcus thermophilus were isolated by selective medium， and their fermentation performance and passaging characteristics were determined. Finally， Lactobacillus bulgaricus and Streptococcus thermophilus with good fermentation performance were selected.The isolated Lactobacillus bulgaricus and Streptococcus thermophilus were mixed fermented in skim milk in different ratios， and the optimum addition ratio of the two was determined.[Result]During the fermentation of yoghurt， when the ratio of Lactobacillus bulgaricus and Streptococcus thermophilus was 1∶1， the fermented skim milk powder could be curd within 4 h， the viable cell count of the fermented product was 5.4×107 CFU/ mL， and the acidity reaches 78.1 °T， pH was 4.50， and the fermentation performance was better.[Conclusion]This study provides a theoretical basis for better application of Lactobacillus in actual production.
Key words Lactobacillus bulgaricus；Streptococcus thermophilus；Separation and purification；Matching of bacteria；Proportion of addition
保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus）和嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）是乳酸菌类的益生菌，也是人体肠道中的重要微生物，二者作为发酵乳制品重要的发酵剂菌种而被广泛应用，具有较高的经济价值和研究价值[1]。菌种的选择和发酵剂的制备不仅影响酸奶和发酵乳饮料的产品质量，而且还直接影响酸奶和发酵乳饮料的产量与经济效益[2]。有研究表明，保加利亚乳杆菌与嗜热链球菌存在互惠共生作用，将不同的乳酸菌进行组合可以发挥其不同的发酵性能[3]。因此，选择发酵性能好的保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌，并掌握生产优质酸奶和发酵乳饮料的最佳添加比例是一个关键。
普通乳酸菌发酵剂的特点是菌种纯正，发酵性能稳定，发酵产物除了乳酸外，还有一定量的风味物质、维生素、抗菌物质等[4]。该试验采用梯度稀释涂布法从酸奶中分离纯化
乳酸菌，选择出发酵性能好的保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌，将分离出来的保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌以不同比例在脱脂乳中进行混合菌株发酵，依据发酵性能确定制作酸奶时保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的最佳添加比例，为其在实际生产中更好的应用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试剂。MRS固体培养基[5]；M17固体培养基[6]；复原脱脂乳培养基（菌种培养用）；灭菌生理盐水（梯度稀释用）；酚酞指示剂。
1.1.2 仪器与设备。
试管、移液管、培养皿、玻璃棒、玻璃珠、烧杯、三角瓶、载玻片、碱式滴定管、量筒、温度计，具体型号规格和厂家见表1。
1.2 方法
1.2.1 基本工艺设计路线。
菌种分离纯化→菌种的搭配→菌种的传代→确定最终菌株及添加比例。最终依据发酵性能选择一种比较好的普通乳酸菌发酵剂配方，发酵性能的好坏主要通过酸度和pH的测定。 1.2.2 菌种的分离。
首先，将市售的酸奶样品进行涂片、美蓝染色镜检观察，确定样品中发酵剂含有保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌。然后用一支10 mL无菌移液管吸取10 mL酸奶样品，放入盛有90 mL无菌水并带有玻璃珠的三角瓶中，用微型旋涡混合器振摇30 s左右，使酸奶样品与无菌水充分混合，将细菌分散。用一支1 mL无菌移液管吸取1 mL酸奶悬液，加入盛有9 mL无菌水的试管中充分混匀，再用一支无菌移液管从此试管中吸取1 mL加入另一盛有9 mL无菌水的试管中，混合均匀，以此类推制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5不同稀释度的酸奶溶液（注意：操作时管尖不能接触液面，每一个稀释度换一支试管和移液管）。最后，取6个倒入MRS固体培养基的培养皿分别贴上10-3、10-4、10-5 3个稀释度各2个标签，用无菌吸管分别由10-3、10-4、10-5 3管酸奶稀释液中吸取0.5 mL，小心地滴在对应平板培养皿表面中央位置。用无菌玻璃棒涂匀，右手拿无菌涂棒平放在平板培养基表面上，将菌悬液先沿同心圆方向轻轻向外扩展，使之分布均匀。室温下静置5～10 min，使菌液浸入培养基。同样的操作加入M17固体培养基再做1次。
将培养皿放在37.5 ℃的数显电热培养箱中培养48 h后，挑起单个典型菌落进行镜检，以确保是否是单菌的菌落，若不是则反复进行以上操作，直至得到单菌落；反之则进行下一步的试验。
1.2.3 菌种的纯化。
挑选典型的球菌和杆菌的单个菌落接种于脱脂乳中增菌复壮培养，然后再进行平板分离，每个平板一般挑选5～7个典型菌落，凝固后镜检，检验脱脂乳中是否有杆菌或球菌的增殖，剔除含污染菌的发酵管，选取较纯的发酵乳管再经梯度稀释，涂布平板培养，以进一步纯化，并用脱脂乳发酵做凝乳试验并滴定酸度，选取发酵性能好的杆菌和球菌。
1.2.4 菌种的搭配。
分别在50 mL脱脂乳（经过保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌凝乳发酵）中接入菌种，总接种量为3%，两菌之比为1∶1，在42.5 ℃的数显电热培养箱中进行发酵培养。根据发酵特性，选出发酵效果较好、凝乳时间较短的组合。
1.2.5 菌种的传代和稳定性测试。
将挑选出来的发酵性能较好的保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌进行传代，用以检测菌种的稳定性。每次取3%的接种量加入到50 mL无菌的脱脂乳中，在42.5 ℃的数显电热培养箱中进行发酵培养直至刚好凝乳，记录凝乳时间，并测定pH和酸度。通过各项指标确定菌种的稳定性。
1.2.6 菌种的比例搭配。
将挑选出发酵效果好的组合，分别再次接入无菌的脱脂乳中（按照保加利亚乳杆菌和嗜熱链球菌的比例为1.0∶1.0、1.0∶1.5、1.0∶2.0、2.0∶1.0、1.5∶1.0，总接种量为3%），在42.5 ℃的条件下进行发酵，凝乳后停止，进行美蓝染色并在显微镜下镜检，观察凝乳后的脱脂乳中球菌和杆菌的比例。通过测定凝乳时间、酸度、pH等指标来确定保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的最适添加比例。
1.3 检测项目
1.3.1 酸度的测定。
采用滴定酸度法，以吉尔涅尔度表示（°T）。取10 mL牛乳，用20 mL蒸馏水稀释，加入0.5%的酚酞指示剂0.5 mL，以0.1 mol/L溶液滴定，将所消耗的NaOH毫升数乘以10，即为中和100 mL牛乳所需的0.1 mol/L NaOH毫升数，每毫升为1°T，也称1度[7]。
1.3.2 pH的测定。
采用两点校正法，用实验室pH计直接测定。
1.3.2.1 酸度计的校正。将电极放入缓冲液中，并按校准键，开始校准，校准和测量图标将同时显示，在信号稳定后，仪表根据预选终点方式终点或按度数键终点。再用去离子水冲洗电极，将电极放入下一个校准缓冲液中，并按校准键开始下一点校准。
1.3.2.2
样液的测定。用无CO2蒸馏水淋洗电极，并用滤纸吸干，再用待测样液冲洗电极，将电极插入待测样液中，按下度数开关，稳定1 min后，酸度计所显示的数值即为待测样液的pH。
1.3.3 凝乳时间的测定。
每次接种后的脱脂乳粉应放入42.5 ℃的电热恒温培养箱中培养，直至凝乳后取出，记录时间。凝乳后的脱脂乳粉应放在4 ℃的条件下保存。
1.3.4 菌种比例情况。通过显微镜涂片观察。
2 结果与分析
2.1 保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的筛选
嗜热链球菌在M17固体培养基上生长，形成卵圆形，表面光滑的黄色凸起菌落，菌落较大，菌落直径为1～2 mm。由于pH 7.1不适合保加利亚乳杆菌的生长，所以M17固体培养基上基本没有保加利亚乳杆菌，或形成模糊不清的羊毛状菌落，易与嗜热链球菌分开。
保加利亚乳杆菌在MRS固体培养基上生长，形成形状不规则、表面粗糙的白色凸起菌落，菌落直径为1～3 mm。由于5.4的pH不适合嗜热链球菌的生长，所以MRS固体培养基上基本没有嗜热链球菌的菌落。
通过美蓝染色在显微镜下观察，嗜热链球菌呈卵圆形，单个细菌直径为0.7～0.9 μm，多个细菌组织形态一般成对或形成长链状，无运动性。保加利亚乳杆菌无运动性，两端钝圆，细杆状，多个细菌成单或成链，单个细菌在乳中长度是0.9～5.0 μm。
2.2 保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的特性测定
分别挑取分离出的保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的菌落各10株，经复原脱脂乳初次培养，筛选出性能较好的4株球菌、2株杆菌，再分别以3%接入质量分数为10%复原脱脂乳培养基，42.5 ℃发酵至凝乳，观察记录凝乳时间、滴定酸度和pH。
从表2可以看出，4株球菌和2株杆菌的pH终点在5%水平上差异均不显著。杆菌2的pH最大，球菌4的最小。 而滴定酸度球菌3的数值最大，球菌2的数值最小，它们之间存在着4.1°T的差异，且最小的滴定酸度66.9°T也满足生产酸奶的需要。在酸度上，球菌1、杆菌2与球菌3、杆菌1差异显著，球菌2与球菌3、球菌4、杆菌1差异也显著。由此可见，以上各株菌种产酸活性都可以达到发酵性能优良的要求，所以这6株都可以作为发酵剂的菌株来使用。
2.3 保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的搭配发酵试验
酸奶是由保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌共同发酵产生的，两者具有良好的相互促进生长的关系，两者在一起的产酸速度高于两者之中单一的产酸速度。保加利亚乳杆菌经代谢活动，分解乳蛋白质产生不同的代谢物质，主要是肽类和氨基酸类物质，如甘氨酸和组氨酸等作为刺激因素，促进了嗜热链球菌的生长；同样，嗜热链球菌在生长过程中产生的一些物质，主要是甲酸类化合物，促进了保加利亚乳杆菌的生长。
选取发酵活力高的球菌（球菌1、球菌2、球菌3、球菌4）和杆菌（杆菌1、杆菌2），将保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌组合起来进行搭配试验。发酵温度为42.5 ℃，总接种量为3%，起始pH相同，且杆菌与球菌的比例为1∶1。试验数据如表3所示。
比较表2和表3发现，在相同的凝乳条件下，杆菌1与各个球菌组合的混菌的凝乳时间比单一的杆菌1的凝乳时间多0.5 h，杆菌1+球菌3的pH终点（4.84）比杆菌1的pH终点（4.79）大0.05。杆菌2与各个球菌组合的混菌的凝乳时间比单一杆菌的凝乳时间缩短了0.5 h。从酸度上看，杆菌2与4株球菌的搭配都大于杆菌2单独发酵的酸度。造成以上现象的原因是与不同的杆菌和球菌生长动力学特异性有关。从pH上看，4种球菌和2种杆菌搭配之间差异均不显著。从滴定酸度上看，杆菌2+球菌3、杆菌2+球菌4差异不显著。从整体上来看，pH较好的为杆菌2+球菌1、杆菌2+球菌2，数值分别为4.69、4.70；滴定酸度较好的为杆菌2+球菌1、杆菌2+球菌2，分别为75.2、73.1 °T。所以选择杆菌2和球菌1、球菌2的组合搭配。
通过对杆菌2+球菌1、杆菌2+球菌2两组发酵乳涂片，并在显微镜下观察发现杆菌与球菌的比例约为1∶1。
2.4 菌种的传代试验
所谓菌种退化，主要是指生产菌或选育过程中筛选出来的较优良菌株，由于菌种进行接种传代或保藏之后，会出现群体中的某些生理特征和形态特征逐渐减退或完全丧失的现象[8]。集中表现在目的代谢物合成能力降低，产量下降。
菌种活性退化会对以后生产酸奶的过程有影响，菌种活性退化严重将限制以后生产酸奶时菌种的使用时间和次数，所以应对杆菌2和球菌1、球菌2做传代试验，研究这3株菌和杆菌与球菌搭配的2种混菌产酸活性退化是否严重。发酵條件是温度37.5 ℃，接种量3%，混菌发酵杆菌与球菌比例为1∶1，起始pH相同。
从表4可以看出，杆菌2传代前2次的pH相同，不存在显著差异，从第3代起pH具有显著性差异，滴定酸度与pH终点的变化差异基本相同，具有相同的趋势。从整体上来看，不论是pH终点还是滴定酸度都存在显著性变化，所以杆菌2有退化的现象。
从2株球菌的传代数据（表5）来看，随着传代次数的增加，其pH终点和滴定酸度都发生了显著性变化，但由于在第5代时2个菌种的滴定酸度还可以稳定在60°T左右，表明它们的稳定性比杆菌2好。这可能是由于杆菌的细胞大，在传代过程中易变形所致。菌种退化不是突然变化的，而是从量变到质变的逐步演变的过程。开始时，在群体细胞中仅出现产量下降的个别突变细胞，不会使群体菌株性能明显改变。经过连续传代，负变细胞达到一定数量，在群体中占了优势，从整体菌株上反映产量下降及其相关的一些特性发生了变化，表现上便出现了退化。
从混菌发酵的传代数据（表6）可以看出，比较杆菌2与球菌1和球菌2的搭配菌种活性退化趋势与单菌种的退化趋势发现，混菌的传代稳定性较好，主要是pH和酸度的数值变化不大，传代5次与第1次的pH和酸度相差不大。所以杆菌2+球菌1、杆菌2+球菌2的传代性能较好。
分别对杆菌2+球菌1、杆菌2+球菌2的每一代进行涂片观察，发现在前2代杆菌与球菌的比例为1.0∶1.0～1.5∶1.0，随着传代次数的增加，杆菌所占的比例不断增大。
2.5 保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的搭配比例试验
对于酸奶良好风味的形成，嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌在发酵过程中要保持大约相同的数量。当酸度到达一定程度，球菌不再生长，相对而言，杆菌较为耐酸。球菌和杆菌的菌株特性必须要相互适配，并不是所有菌株的配合都是适宜的。
球菌和杆菌的比例在不断变化，起始时由于杆菌产生的刺激因子，球菌生长较快，之后由于酸的积累，球菌生长缓慢；后来，由于球菌产生的甲酸和二氧化碳，杆菌快速生长，最后两者比例达到初始发酵时的比例，接种量增大会加快产酸速度，这样很快会使球菌生长停止，导致杆菌比例增高（在相同培养时间情况下）；接种量少，则相反。所以该试验对杆菌和球菌进行了比例搭配试验，试验相关数据如表7所示。发酵的条件是温度42.5 ℃，总接种量3%，起始pH相同。
从表7可以看出，杆菌2与球菌1和球菌2以1.0∶1.0、1.0∶1.5、1.0∶2.0、2.0∶1.0、1.5∶1.0的比例搭配时，pH均没有显著差异，杆菌2和球菌1、球菌2搭配的滴定酸度是有显著性的。当杆菌2与球菌1混合时，比例为1.0∶1.0时，它的滴定酸度是最大的，且pH最小；比例以1.0∶1.5混合时，滴定酸度次之。杆菌2与球菌1、球菌2在以2.0∶1.0混合时，滴定酸度均是同条件下不同菌种比例时的最低。另外保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的比例是1.0∶1.0时乳凝固状态最好，故当保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的比例是1.0∶1.0时两菌共生效果较好，发酵酸奶时用此比例更适合。
对保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌之比为1.0∶1.0且凝乳状态最好的酸奶采用平板菌落计数法，测得活菌数为5.4×107CFU/mL。 3 结论
通过对保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的特性测定，选择出2株杆菌、4株球菌，它们的pH为4.73～4.83，酸度为66.9～71.1°T。
通过将杆菌1、杆菌2分别与球菌1、2、3、4按1∶1（总接种量为3%）的比例搭配发酵，选择出凝乳时间均为4 h的杆菌2+球菌1、杆菌2+球菌2的两组搭配，pH分别为4.69、4.70，酸度分别为75.2、73.1°T。
通过对保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的搭配比例试验，得出保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌之比为1∶1时，两菌共生效果好，更适合酸奶发酵。
综上所述，保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的添加比例为1∶1时，发酵脱脂乳粉可以在4 h内凝乳，发酵产品活菌数为5.4×107 CFU/mL，酸度达78.1°T，pH为4.50，发酵性能较好。
参考文献
[1] CRITTENDEN R G，MARTINEZ N R，PLAYNE M J.Synthesis and utilisation offolate by yoghurt starter cultures and probiotic bacteria[J].International journal of food microbiology，2003，80（3）：217-222.
[2] 田洪濤，万红兵，刘宽庆，等.酸奶冻干发酵剂制备中保加利亚乳杆菌不同菌株特性的研究[J].中国乳品工业，2006，34（12）：4-6.
[3] SKRIVER A，STENBY E，FOLKENBERG D M，et al.Tools in the development of future starter cultures for fermented milk[M]//Proceedings of the IDF seminar on aroma and texture of fermented milk.Brussels，Belgium：International Dairy Federation，2003：55-61.
[4] 乔发东，吴秀芳，南庆贤，等.浓缩乳酸菌发酵剂的现状[J].中国乳品工业，1998，26（1）：22-23.
[5] 吴定，孙德坤，解光艳，等.乳酸菌的分离、鉴定和驯化[J].安徽农业技术师范学院学报，2000，14（1）：5-7.
[6] VINDEROLA C G，REINHEIMER J A.Culture media for the enumeration of Bifidobacterium bifidum and Lactobacillus acidophilus in the presence of yoghurt bacteria[J].International dairy journal，1999，9：497-505.
[7] 张和平，张佳程.乳品工艺学[M].北京：中国轻工业出版社，2009：425.
[8] 余龙江.发酵工程原理与技术应用[M].北京：化学工业出版社，2006：39.